基因缺失疫苗研制课件

传统疫苗：不能区分自然感染野毒和疫苗免疫猪基因缺失疫苗：缺失主要毒力基因（TK）和非必需糖蛋白基因（gG或gE），使临床上实现区分自然感染野毒猪和疫苗免疫猪成为可能。以鄂A株为亲本的

TK-/gG-/Lacz+、TK-/gE-

双基因缺失弱毒活疫苗和gG-、gE-单基因缺失灭活疫苗为临床上区分PrV自然感染猪和疫苗免疫猪,达到最终根除该病提供了有效的工具。利用体外表达被缺失的糖蛋白基因作抗原，建立鉴别诊断方法，为逐步淘汰自然感染猪，建立健康猪群，最终实现消灭伪狂犬病的目的。基因缺失疫苗研制基因工程突变株的构建及疫苗研制

从PrVEa株基因组DNA文库筛选含TK基因的文库片段

缺失TK基因将LacZ基因表达盒插入gG基因使其失活将LacZ基因表达盒插入gE基因使其失活

与Ea株野毒基因组重组

TK-缺失突变株与Ea株野毒基因组重组

gG-/LacZ+突变株TK-/gG-/LacZ+缺失突变株gE-/LacZ+突变株TK-/gE-/LacZ+缺失突变株

基因缺失活疫苗研制油乳剂灭活苗

动物试验动物试验

田间中试田间中试重组已构建的基因工程突变株

TK-/LacZ+

TK-

gG-/LacZ+

TK-/gG-/LacZ+

gE-/LacZ+

TK-/gE-TK-/gG-/LacZ+双基因缺失疫苗株对小白鼠毒力的测定

病毒毒株试验动物数量LD50

TK-/gG-/LacZ+

Balb/c小鼠60>10-1.0/0.1mL

鄂A强毒株6010-25/0.1mLBartha株6010-1.0/0.1mL与Bartha株相比，TK-/gG-/LacZ+缺失株对小白鼠的毒力更低TK-/gG-/LacZ+双基因缺失疫苗株对妊娠母猪的安全性试验

接种剂量试验动物数产仔成绩数活仔数死胎数流产数107.0TCID50

2222200106.0TCID50

2202000105.0TCID50

2232300对照组

3303000将TK-/gG-/LacZ+疫苗毒株作10倍系列稀释，即10-1、10-2、10-3滴度，接种妊娠40-90天的母猪，观察其产仔成绩，以确定该疫苗对妊娠母猪及胎儿的影响。试验结果说明，107.0—105.0TCID50的剂量接种后，母猪均能正常产仔，对胎儿均不造成损害，所产仔猪无死胎、木乃伊胎，与非接种疫苗对照组之间的差异也不显著（P>0.05）。

TK-/gG-/LacZ+双基因缺失株对1日龄仔猪的安全性

接种剂量(TCID50)动物数(头)接种前(℃)接种后（天）体温变化(℃)

123456107.0106.0105.0对照755439.3±0.1839.4±0.2439.8±0.1839.3±0.2839.1±0.2438.4±0.1938.8±0.2739.3±0.2839.5±0.3439.2±0.2239.9±0.1939.0±0.2139.4±0.3539.4±0.2439.5±0.2138.7±0.1939.9±0.3439.4±0.2740±0.1939.3±0.1840.0±0.2639.2±0.1939.1±0.2839.6±0.2039.6±0.2839.3±0.2139.5±0.2439.9±0.18将TK-/gG-/LacZ+疫苗株病毒按原液、10-1、10-2、10-3稀释度，接种1日龄仔猪，观察其精神状态、测量体温，观察21天，确定其安全性.这几组接种疫苗的仔猪至21日龄时全部存活，无一死亡；各剂量组之间、各剂量组与对照组之间引起仔猪的体温变化差异不显著（P>0.05），而且不导致发热反应（≥40℃）。不同剂量TK-/gG-/LacZ+突变株免疫

21天后攻毒的体温变化

接种剂量组攻毒前体温动物数(头)攻毒后（天）的体温变化

123456107.0106.0105.0对照组38.9±0.3139.0±0.2839.0±0.2838.9±0.19755439.0±0.2039.2±0.1739.5±0.1939.7±0.2139.4±0.1939.5±0.1940.2±0.1939.6±0.2439.3±0.2539.3±0.2839.1±0.2139.6±0.1939.5±0.3939.7±0.2439.1±0.1939.9±0.2839.2±0.2639.6±0.1639.5±0.2739.7±0.2939.3±0.1939.2±0.2739.5±0.2439.3±0.27TK-/LacZ+突变株的构建TK-突变株与野毒株所形成空斑的比较左图为Ea株亲本形成的空斑右图为Ea株TK缺失突变株形成的空斑gG-/LacZ+突变株的构建gG-/LacZ+突变株形成的蓝斑TK-/gE-突变株的构建

TK-/gG-/LacZ+突变株形成的蓝斑伪狂犬病TK-/gG-/LacZ+双基因缺失疫苗生物学特性动物实验遗传稳定性安全性与免疫效果免疫剂量与免疫程序中试与区域试验已通过了农业部生物安全性评价申报了新兽药证书，按照新兽药证书的要求，完成了TK-/gG-/LacZ+双基因缺失疫苗株与其它

毒株在不同细胞上的生长滴度

毒株细胞类型培养条件TCID50

鄂A强毒株IBRS-2大扁瓶，静止培养，37℃

10-7.0/0.1mL

TK-/gG-/LacZ+

IBRS-2大扁瓶，静止培养，37℃10-7.0/0.1mL

鸡胚成纤维细胞1万毫升瓶，旋转培养

10-5.33/0.1mL

Bartha株IBRS-2大扁瓶，静止培养，37℃10-6.0/0.1mL

在猪源细胞（IBRS-2）中，该疫苗毒株与亲本毒株（鄂A株）增殖滴度未发生改变，Bartha株增殖能力较低。基因缺失株在鸡胚成纤维细胞增殖滴度为10-5.33/0.1mL

。TK-/gE-/LacZ+突变株形成的蓝斑TK-/gG-/LacZ+双基因缺失疫苗的研制按常规方法制备鸡胚成纤维单层细胞，将TK-/gG-/LacZ+双基因缺失突变株按所加培养液1：10的比例接种到鸡胚成纤维单层细胞，吸附1小时后，加入培养基，转瓶培养，出现细胞病变后冻融细胞收毒。经测定，TCID50为10-5.3/0.1ml。理论上，1ml病毒液可以作为13个免疫剂量。该疫苗株的增殖滴度已能满足大规模生产疫苗时对抗原量的要求。将1ml病毒培养液加入适当的保护剂后按《兽用生物制品学》的要求进行冻干、抽真空、加塞等过程，制成冻干活毒疫苗，用于实验室检测和部分田间试验。冻干活疫苗置-20℃保存，每隔2个月抽样测定疫苗活病毒的含量，未发生明显变化，疫苗可保存12个月以上。

该疫苗的独特效果

可用于新生仔猪的超前免疫，安全性高可用于紧急预防注射，16-24h左右产生极显著的治疗效果产生的抗体水平高、作用时间快、安全性高、免疫效果好等方面都超过国外的同类产品。通过在全国100万头份的临床应用充分证实了这一效果的确实性和可靠性与国外同类产品的技术参数比较使用疫苗免疫剂量动物数免疫后1个月中