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文档简介

DNA重组（2）

（载体与目的DNA重组分子的转化）实验重组体的检测和转化子的筛选

重组体的检测：包括重组载体的检测，酶切，PCR检测，杂交，测序等。转化子的筛选：抗生素筛选、报告基因、基因生物活性检测等。β-半乳糖苷酶 乳糖→半乳糖+葡萄糖诱导物： 异乳糖

IPTG（异丙基-β-D–硫代半乳糖苷）

底物：

X–gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）

X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因蓝白斑筛选:pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSβ-半乳糖苷酶的a-肽段a5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷X-gal5-溴-4-氯-靛蓝（ß-半乳糖苷酶）lacZAmN2H片段COOH片段E.ColiDNA质粒大肠杆菌（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶无外源基因插入有外源基因插入载体：多数质粒都含有半乳糖苷酶的前143个氨基酸的编码序列和调控序列。编码序列中了包含一个MCS，它不破坏读框，不影响功能宿主菌：编码半乳糖苷酶C端部分序列分别编码的片段均无活性，但可融为一体，形成具有酶活的蛋白质---互补来自-互补的菌在含有X-gal的培养基中形成蓝色菌落有外源片段插入载体时，导致无-互补能力的氨基端片段，形成白色菌落简单的颜色反应给重组子的鉴定带来了极大的方便，从成百上千的转化克隆中可以很容易的挑出携带重组质粒的白色克隆lacZβ-半乳糖苷酶分解半乳糖iPO调控蛋白P大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统诱导剂IPTGa-互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ-β-半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO调控蛋白Pα-肽段分解X-gal产物呈现蓝色诱导剂IPTGβ-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15实验材料重组DNA连接产物高效感受态细胞DH5α

20mg/mLX－gal（5－溴－4－氢－3－吲哚－－D半乳糖苷）

20mg/mLIPTG溶液LB固体平板（Ap+）和液体培养基试管、涂棒等

50uL感受态细胞+10uL连接产物，

25uL感受态细胞+2uL无菌水（阴性对照）混匀，冰上放置30分钟。42°C水浴，90秒,冰上放置1-2分钟每管加900uLLB液体培养基，轻轻混匀，37°C摇床慢摇，温育40分钟

转化实验连接产物转化管：4000rpm离心5分钟，吸出弃去800uL上清液后，轻轻混匀菌体，将剩余200uL菌液均匀涂布在含x-gal的平板上。（注意编号!）阴性对照分别取100uL菌液涂布一个含Ap+平板和一个无Ap平板。注意：涂棒在酒精灯上烧后需冷却！37°C倒置培养过夜。1、抗药性标记选择(插入失活法)

2、α-互补4、β-半乳糖苷酶显色反应法培养基中含X-gal和IPTGX-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚B-

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