基因工程菌种类、特征及其构建方法

生物制药工艺Biopharmaceutical骆健:生物制药工艺学（教学安排 第五章多肽与蛋白质药物（2学时）第六章核酸药物（2学时） 第八 糖类药物（2学时主要参考（普通高等教育“十一五”国家级规 2007年7 吴梧桐主编.《生物制药工艺学》（第二版），中国科技（高等院校药学类规划），2006年2月。 吴晓英主编.《生物制药工艺学》，化学工业出 第四 工程制药工前 工三个概念 工程 工程制上两个阶两个特

下一般特自身特为什为什工程药物成研究热点天然药通过化学方法合成的药工程药工程药物的3个阶细 工细 工程药物 利用 动物生产低成本、高活性的药 工程gene体行切割、拼接和重新组合入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。工程（重点geneticallyengineered微生物为操作对象，通工程技术获得的时也叫重组菌 binantmicroorganism) 或过时也叫重组菌 binantmicroorganism)细细菌和酵母是重要的表达重组药物的制工程制药（重点 切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整或以质粒形式单独在细胞中繁殖，并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物。19731973年重组DNA技术建19901990动人组计划1999国加入组计划2003年多国科学家宣布完成所有1976年世界上第一 工程技术开发药物的公- 技术公1982年世界上第一 工程药物重组人胰岛 礼来公工工程技术首先领域，主要领域实，现有60-工程药物的研究和商品化已上市或研究热点 工程药物主要有（1）乙型肝 （2）人白细胞干扰 工程人胰岛素（4）人白细胞介素人生长激素人组织纤溶酶原激活剂人促红细胞生成素细胞集落刺激因子世界生物技术药物的销售额将以年均世界生物技术药物的销售额将以年均0-5％速度增加， 工程药物在药物市场中将占5％。生物技术的发源地,工程药物的国家,据统计约2000家(包括1300公司其中约300 欧洲共有约欧洲共有约1000家生物技术公司, 体和5 重。•实力及市场。 通产估计，2001年 总市场达到3兆日元。我 工程药物研究开发现 工程一类新药α1b干扰素,成为我国批准生产的第一个 工程一类新药，成为“863”计 (重点(重点获目将重组体入宿获目将重组体入宿主细构DNA重组除菌过分离纯除菌过分离纯表达产培工程半成品检半成品检制成品检包工程药物生产过程中的关键问目 的获——首先必须获得符合人们要求的 段，这种

适当的载体质粒或噬菌体中并转——表达系统的要保证表达的蛋白质的功能，其次是表达量的多少和分离纯化的难易。大肠杆菌和其他宿主菌（细胞），——表达系统的要保证表达的蛋白质的功能，其次是表达量的多少和分离纯化的难易。。我我国术”与国际水平相比3－5年但“下游技术”却少相差15 上 工工制药技 下

获得目获得重组 工程菌的发制成品的检定工程制药工艺的特一般特点发酵在常温常压下进行，反应安全，对条件的要求比较简单；原料可使用农副产品，来源广泛，使用方便。自身特点（重点发酵产物比常规菌更加纯粹和单一能大幅度提高产物的含量能合成外 编码的产物工业化生产的关键问 第四 工程菌发酵制药工工程菌的种类、特征及其构建方法（2学时工程菌发酵的分子与细胞学基础（2学时工程菌的发酵动力学特征（2学时工程菌发酵的工艺过程与操作技术（2学时工程菌发酵培养过程的检测与控制（2学时本节主要教学要求掌握工程菌的概念，熟悉工程大肠杆菌和酵母表达系统的生物学特性和表达特点，掌握工程工程制药微生物表达系大肠杆菌表达系酵母表达系工程菌的构工程大肠杆菌的构工程制药微生物表达系选择依据：表达功能；表达量的多少；分离纯化的难生物生物学系表达特优点优点与不应用情ⅰ）细胞壁：较薄，约3nm。由肽聚糖和脂多糖构成。细胞 性的内毒素，具有抗原性，大肠菌产生热ⅱⅱ）外膜：细胞壁外ⅵ）拟核：细胞核无核膜，一条环状ⅵ）拟核：细胞核无核膜，一条环状

常为细胞分泌的蛋白质所占据。工）细胞质：呈浆状，含有各种生物大分子。如酶、mRNA、tRNA、核糖体，有机化合物及离子，代谢的主要场所。细胞质含有细胞核外遗传物质，如质粒为双链环状DNA，负责细菌的抗性，有编码抗生素的等，是进 工程的重要载体

和排出废最简单原核细最简单原核细胞生物、杆状，(2-4)μm×(0.4-单细胞微生物，裂殖37℃下，17分钟繁组于1996年完成组大小为4600组于1996年完成组大小为4600阅读开放开架4288个，编码3000多种蛋白质质粒（plasmid）是一类存在于细 工程中发展最早、应用最广泛的经典的表达系统工程中发展最早、应用最广泛的经典的表达系统—大肠杆菌K-12株的衍生外源蛋白的表达形式：细胞内的不溶性表达和细胞内可溶性表达。外源蛋白的表达形式：细胞内的不溶性表达和细胞内可溶性表达。细胞内表达的主要位置是在细胞质优点：（1)表达质粒构建简单；2）目标蛋白的表达量高；缺点：容易形成包涵体，尤其真核 表达。不溶性表达：细胞质内形成包涵优点能够表达对大肠杆菌宿 或者致死效应的外源蛋白缺点：获得活性产物必须经过变性、纯化、复性等过程，不仅增加了工艺的难度和成本，而且不是所有的产物都能完全恢复到一致的活性，产品质量不易控制。可溶性表达：存在于细胞质。可经过加工 分泌到周质优点缺点（1）细胞质微环境的氧化还原态势不利于二硫键形成，目的蛋白在细胞质中不能正确折叠；（2）哪一种表达形式更有利优点(1)外源蛋白从细胞质转运到周质空间中信号肽被切除，有效避免N••发展••发展最早、应用最广泛的经典遗传背景清楚、目表达水平高（达70％）养周期短，抗污染优不 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提；没有内质网、高尔基体等蛋白翻译后修饰加工的亚细胞器，糖基化、酰胺化等；细胞后，细胞壁脂多糖游离出来形成内毒素，具有抗原产物蛋白质的N 白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白 ）等(3-6)μm×(5-10)μm。酵母菌无鞭毛，不能游动酵母系生物学特酵母生长迅速酵母生长迅速，倍增期酵母细胞结甘露聚糖（外层酯类、蛋甘露聚糖（外层酯类、蛋白（中间层少葡聚几丁因种厚度为0.2荚膜物质荚膜物质：有些酵母（例如：隐球酵细细胞核：酵母菌具有由多孔核起来的定形细胞核线线粒体：两层单位膜包围的一种细胞液泡液泡：单层膜包围的一种细胞器内质网：由脂质双分子层围成的细胞器成熟细胞长出一个小芽，到一定程度后脱 继续长成 酵母两 不同的单倍体细胞靠近，相互接触接触处细胞 ，质核配 能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等 酿酒酵母有17， 1996年完成其 ，遗传背景已经相当清楚 组为12068kb，阅读开放开架5887个，编码约 。比单。比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级1974年Clarck-Walker和Miklos 酵母的表达载体是穿梭载体，能在大肠杆菌和酵母中复制。克隆在此类质粒上的外源可以不用更换载体直接从一种宿主菌转入另一种宿主细胞中并且遗传。优点①遗传背景清楚，是研 表达最有效的单细胞真核微生物②遗传操作容易、安③繁殖迅速，培养条件简单，大规模培养技术成④亚细胞器分化，能进行蛋白质翻译后的修饰和加工（产物可糖基化），缺点①修饰的蛋白质糖基化侧链过长，过度糖基化会引起副②酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密③毕赤酵母可克服酿酒酵母的这两个缺陷，糖基化功能更接近高等真核生改造难度大。1981年Hitzman 激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭细胞因子：粒-巨噬细胞集落刺激因（GM-CSF）（细胞集落刺激因子：刺多肽类 等，8种产 人粒细胞集落刺激因德国：Merck公

丹麦:诺和诺

：Immunex公第二：大肠杆菌质粒又是最常用的质粒，因为大肠杆菌质粒上有诸如抗青霉素等易于检测的标记，并且容易使目的在宿主细胞中和表达。第三：大肠杆菌是一种典型兼性厌氧细菌，由于体积小，表面积与体积的比例很大，并且能利用氧气进行彻底生物氧化释放大量能量，因而能够与外界迅速进行物质和能量交换，并在体内迅速转化。这样一来使大肠杆菌新陈代谢极其迅速，就如同一个效率极高的化工厂，而与真正化工厂相比所需反应条件又很温和，容易达到，其经济效益是显而易见的。工程菌的构— 工程大肠杆菌 工程菌的构建是生物药物生产的前提，菌株的优劣直接关系到生产的成败。工程菌具备的条件（重点容易培目表达目表达载体DNADNADNA分子体外重组过目 的获 tinggene)：编 目标的正确克隆在整个构建中至关重要，因为只要有一个碱基发生变化就可能导致编码氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能和生物学活性。目目 克隆的方PCR扩增：容易简文库筛选：适合未知序列 克隆，过程繁琐复杂，成本昂化学合成：完全已知的序列，适合较 （小于100bp）PCR扩增目聚合酶链(polymerasechainreaction,PCR)由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA序列进行 反应本质：生物体的 发明者：1985年，Mullis，生物技 性象征ABI*2720/9700型PCRPCR是一个重复性的循环过程PCR是一个重复性的循环过程,每循环结束，目的片段的数量PCRPCR 模板DNA:待扩增的目 序列,100－10000bp,引物:两条寡核苷酸。引物设计对扩增成功、特异性与效率至关重要。根据目标 序列，设计上下游引物，长度一般为21～27p。注意退火温度，一般在50-65之间，温度越高，特异性越强，防止二聚体和发夹结构的形成，目前有很多计算机软件辅助设计引物，可供使用。脱氧核苷酸：4dATP,dCTP,dGTP,Taq聚合酶，Vent酶和Tli酶比Taq酶更好，具有更高的保真性和热稳定性，可根据克隆的长度和要求选择。缓冲溶液：50mMKCl、10mMTris－HCl,1.5mM退火温度：低；太低不能特异配对，引起非特异性扩增。一般比理论计算温度值低35℃。延伸温度：聚合酶最适温度，一般72-78℃PCR循环数：根据加入的模板DNA量、扩增效率而定。一、无引物、无聚合酶等对照，以便检PCR的进行和结果设计PCR程序(温度,时间,循环数)，目标优化退火温度和时间 符的扩增产物及其特异性。表达表达载体的构建过程与目 克隆相似 表达载体：expression在质粒载体的基础上，在多克隆位点 外 表达盒构适位点上的任何外源均能在宿主细胞中高效表达。最常见的大肠杆菌来源的启动子是lac，tac等正调控和lacI的负调控。IPTG等乳糖类似物是其诱导物。Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子)：仅受lacI调控，不 菌体启动子，受lacI阻遏，能被IPTG诱导表达。（30℃）阻遏物有活性，抑制转录，而高温（42℃）？？该实验流程中对是什么克隆非常重要的一目 的扩酶切鉴定：是否有目 方向是否正 确证：目 的序列准确无误，阅读框架通读概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相 反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上终止反应：加热；加入EDTA酶切完全性的电泳检查：只有末端完全匹配的目标片段与质粒片段才能实现正确的，不完全酶切会大大降概念：在连接酶的催化下，将DNA双链上相邻的3′羟基和5′磷酸共价结合形成3′-5′磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口连接体系：具有可连接末端的片段、载体片段、缓冲液、连接酶（大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接）。连接反应：16℃-26℃，0.5-8小时,或过夜终止反应：在70℃加热10分钟转化（转化（transformation）:某 型细胞的DNA型细胞从周围介质中吸收型和表型发生相应现象.或者也可以说将重组DNA分子 binantmolecule）人工导入到宿主细胞的过程常用方法有物理、化学、生物学等多 。对于大肠杆菌最常用CaCl2 感受态，热击法实现转化转化后的细胞类型有转化子（transformant）：含有载体或重组分子的转化细胞;非转化子（nat）：无载体或重组分子的宿主细胞;重组子（binant）有重组DNA分子的转化细； binant）：仅含有空载体分子的转化期望重组子(目标重组子)：只含有目 的重组子非期望重组子(非目标重组子)：不含目 的重组；DNA体外重组实验中，外源N 段与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，由于重组率和转化率不可能达到，因此必须使用各种筛选与鉴定 区分。从大量被转化的宿主菌中筛选出含有完整表达载体或外、遗传性稳定、能够高效表达出目标产物的重组菌胞克隆对构建正确的表达载体，经适当的转化单单菌落的抗生素筛选、蓝白斑筛选、菌落杂交、PCR等胞克隆取单菌落划线在另一固体平板培养基比较各克隆之间的单细胞所含的质粒拷贝数。对质粒进行酶切和PCR扩增鉴定，筛选鉴定质粒的完整性和所含质粒是否为表达载体。对酶切鉴定正确的克隆进行质粒，筛选外源编码序列准确无误的克隆目标

工程 内容工程菌的遗传稳定性筛 DH5a菌转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现αBL21(DE3)菌用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体如T系列）的 。7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体区，该区整合于BL2的 上。该菌适合表达非毒性蛋白。BL21(DE3)pLysS菌 JM109菌活性，由此很容易鉴别重组体菌株。TOP10菌HB101菌菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各 重组实验RosettaTM菌 工程菌的表达筛 常常以表达目标蛋白质的量及形式（DS－PAG电泳检查）为主要 对象，结合表达载体的稳定性，对转化细胞进行筛选，获得遗传性稳定、高效表达的工程菌。工程菌的表达产物根据质粒的类型分为工程菌的表达产物根据质粒的类型分为工工程菌表达时的影响参数：接种量、诱导条件（导物浓度、诱导时间、发酵温度）、诱导前细胞生长间、诱导后细胞密度、培养基组成及其添加物等诱导物的浓度及其发酵温度：影响产物的表达量，甚至是产物的存在形式.1)1)启动子：lac（乳糖启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)、T7噬菌体启动子等2)2)启动子：PL、PR启动 达目 的细胞才能用于工业化生产 表达部位：胞外，周质，胞内；存在形式：包涵体，可形成包涵体的原 只靠只靠PAGE能否确定目标蛋白的表达？如果不能，还有什么方法？ 表达产物的不稳定 外 大量表达产生特异蛋白时，代谢压力相当大质粒不稳定 不稳定性： 质粒分配不稳定性：质粒在子代细胞中分配不均一而导致部分 质粒结构不稳定性由于质粒DNA中的缺失、 培养条件引起的质粒不稳定性：质粒的稳定性与生长速率的变化相关。一般条件下，携有质粒细胞的生长速率低于无质粒细胞。怎么通过实验分析质粒的不稳定性主要是质粒稳定性试验。常用平板稀释计数和平板点种法以菌种的选择性是否存在来判断质粒的丢失情况即分配稳定性平板点种法是将菌液涂布在非选择性培养基上，长出 再接种到选择性培养基上，验证质粒的丢失此外，结构稳定性的检测需要从单菌落中提取质粒，酶切凝胶电泳 分析其结构是否发生变化。也可对单菌落进行标产物蛋白质的表达分析，由此推断目标DNA的结构是否发生化培养条件与质粒稳定性的关(1)(1)温 如大肠杆菌最有利于质粒稳定的温度是3