临床免疫定性检测的性能验证

临床免疫定性检测

的性能验证高速列车性能验证空气动力学速度车体转向架运行固定、悬挂的零部件强度稳定性舒适感故障率……第3页测定系统方法学操作程序校准品仪器试剂测定系统的关键要素医学检验为什么需要“性能验证”？评价检测系统是否满足临床检测和认可组织的要求（ISO15189）；验证厂家提供的试剂参数能否在本实验室得到重现。什么时候进行性能验证使用新的检测试剂或系统时；更换检测试剂或系统时。更换新的试剂或系统意义：更易于操作更高的检测性能更经济更能满足实验室测定要求

一.

定性临床应用与分类1、定性测定的临床应用免疫学测定：感染性疾病、肿瘤标志物核酸和基因检测微生物检验细胞学检验寄生虫检验2、定性实验的临床分类筛查实验：如便潜血、TP诊断实验：如微生物学培养与细菌鉴定确认实验：对以上已做出的检验结果进行验证和确认3.几个重要概念

筛查试验：临床上筛查方法通常用于检测整个人群（或者人群中的特定部分）中特定指标的情况。例如对需输血患者样本做HIV血清学试验。

一般来说，这些用于筛查的定性试验必须具有高敏感性以确保真阳性结果的检出。如果筛查试验的假阳性结果所造成的社会及经济后果不是非常严重，这种低特异性可通过特异性较好的确认试验加以弥补。CLSI

EP12-A2

UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;Approved

Guideline3.几个重要概念诊断试验：通常用于临床怀疑某种特定疾病或状况是否存在的诊断性定性试验。例如各种微生物培养就是用于检查感染情况的诊断试验。

临床上对治疗的要求，诊断试验应具有很好的敏感性和特异性。如果诊断试验后还进行确认试验，那么诊断试验的特异性要求可以稍微降低。CLSI

EP12-A2

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Guideline3.几个重要概念确认试验：确认试验用于验证筛查试验或者诊断试验结果。如果确诊试验证实了之前的检测结果，临床医生即可作出诊断。确认试验通过设计使其具有较高的特异性（有时甚至以牺牲敏感性为代价）以及高阳性预测值。免疫印迹试验就是一种用于HIV血清学试验等筛查试验之后的确认试验。3.几个重要要概念敏感性或阳性测测定能力力指数（（DI（＋）））：可定义为为一实验验对阳性性标本测测定后给给出阳性性结果的的能力。。DI（＋）=[真阳性/（真阳性性+假阴性））]×100%特异性或阴性测测定能力力指数（（DI（－）））：则为对阴阴性样本本测定给给出阴性性结果的的能力DI（－）=[真阴性/（真阴性性+假阳性））]×100%3.几个重要要概念阳性预示示值：即测定为为阳性的的标本实实际上为为阳性的的可能性性。=[真阳性/（真阳性性+假阳性））]×100%阴性预示示值:则为一份份给出阴阴性结果果的样本本实际上上为阴性性的可靠靠性。=[真阴性/（真阴性性+假阴性））]×100%临床诊断（金标准）总计阳性阴性验证方法阳性ABA+B阴性CDC+D总计A+CB+DN敏感度=100%×[A/（A+C）]特异性=100%×[D/（B+D）]相关样本本的患病病率=100%××[（A+C））/N]阳性预测测值（PVP））=100%×[A/（A+B）]阴性预测测值（（PVN）=100%×[D/（C+D）]方法效率率（正确确率）=100%×[（（A+D）/N]“预示值””对临床床检验结结果影响响预示值对对一个有有95%敏感性和和95%特异性的的试剂检检测结果果的影响响（100,000人）

结果10%感染率1%感染率

检出(+)未检出(－)

检出(+)未检出(－)+9,50050095050

－4,50085,5004,95094,050敏感性(TP/[TP+FN])95%95%特异性(TN/[TN+FP])95%95%阳性预示值TP/[TP+FP]9500/[9500+4500]=67.9%950/[950+4950]=16%阴性预示值TN/[TN+FN]85500/[85500+500]=99.4%94050/[94050+50]=99.9%二.定性检测系统统的性能能验证验证的内内容:1.正确度（（准确度度）2.精密度3.敏感性4.特异性5.CUTOFF值值验证6.其他（需需要时））EP15A2EP17AEP12ClinicalLaboratoryandStandardsInstitute(CLSI)涉及免疫疫定性检检测评价价方法标标准医学实验室精密度和准确度的确认检出限与定量限的评价定性检测评价临床实验验室标准准化协会会性能验证证前的准准备应熟悉待待验证的的试剂或或系统进行必要要的培训训，包括括样本的处处理和储储存、试试剂的处处理和储储存、合合理的检检测方案案、对结结果合理理的解释释以及系系统的质质量控制制等。制定质质量保保证计计划确定患患者样样本的的数量量及强强弱（（评价价重复复性））确定比比较的的方法法CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline性能验验证的的合格格标准准从何何而来来？试剂盒盒说明明书国际和和／或或国际际标准准性能验验证前前样本本的准准备质控品品：使使用商商品化化质控控物进进行，，包括括阴性性和阳阳性。。样本的的采集集和保保存：：采集集时间间、保保存方方式等等必须须保证证一致致性。。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline方法比比较用样本本数量量取决于于评价价者的的目的的。作为最最低要要求，，检测测要持持续到到至少少用比比较方方法获获得50个阳性性样本。并且至至少用用比较较方法法获得得50例阴性性样本以确定定此种种检测测方法法的特特异性性。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline1.准确度度验证证1）检测已已知值值的参考物物质室间质质评材材料(卫生部部或者者CAP)厂商提供的的已赋值的的参考材料料分析用参考考方法或决决定方法定定值的材料料。2）方法比比较试验：：样本数为为10-20个，两种方方法同时测测定同样的的样品，用用KAPPA检验方法分分析两种方方法检测结结果一致性性.(比如HBV酶免法和发发光法比对对)选取40份份（20份份）样本,最好阴阳阳性各半↓随机盲法重重新分号↓检测样本↓将所有检测测结果汇总总填表↓计算评价性性能指标2.精密度验证证1）批内精密度度:同一份样本本在同一批批次内平行行重复检测测10次.然后计算均均值,SD和CV.2）批间精密度度:同一份样本本连续检测测10天,每天平行检检测双孔.然后计算均均值,SD和CV.Note:用S/CO比值进行统统计计算.最好选择临临界值,或弱阳性样样本.判断标准:批内CV小于15%,批间CV小于25%.批内重复性性的验证高、中、低低三个浓度度的样本，，在一批检检测内，重重复检测20次（孔），，计算所得得S/CO值的均值和和SD，计算批内内CV%。判断结论：：应≤试剂剂说明书所所标明的批批内变异。。ELISA的批内变异异CV%应≤10%。批间重复性性的验证高、中、低低三个浓度度的样本，，在10天以上时间间内单次（（孔或管））重复进行行20批检测，计计算所得S/CO值的均值和和SD，计算批间间CV%。判断结论：：应≤试剂剂说明书所所标明的批批间变异。。ELISA的批间变异异CV%应≤15%。3.敏感性1）验证方法法:取10-20份已知真阳阳性的样本本，用常规规检测方法法检测，计计算检测阳阳性的样本本占样本总总数的比例例。2）样本来源源:临床诊断的的阳性病人人血清；厂家提供的的阳性对照照；决定性参考考方法检测测阳性的样样本；以上阳性样样本来源紧紧张时，可可以进行稀稀释（如2：3，3：4这样稀释））4.特异性1）验证方法：选取20份正常健康康人血清（（一般取自自健康体检检者），计计算其检测测阴性结果果所占百分分率。2）样本来源:体检样本,体检者确认认符合要求求后即可.NOTE:部分项目在在健康体检检人群中阳阳性率也很很高,此类项目特特异性验证证很难执行行,建议引用厂厂家说明书书.比如麻疹病病毒IgG,CP-IgG,MP-IgG等一系列病病毒抗体IgG.因为很难确确认体检者者既往是否否有过感染染史,而IgG抗体在体内内存留时间间长.因此很难收收集到真正正意义上的的阴性样本本.特异性验证证（干扰））特定病原体体以外感染染性疾病患患者的样本本。含有干扰性性物质的样样本：类风风湿因子（（RF）阳性、含含异嗜性抗抗体、溶血血、脂血、、高胆红素素样本。结果判断：：非特定病病原体感染染患者样本本均应为阴阴性。含一一定浓度干干扰物质的的样本检测测应为阴性性。5.CUT-OFF重复性和测定下限限验证CUT-OFF重复性验证证：样本浓浓度应接近临界值。不宜用阴性性或强阳性性样本。批内和批间间变异验证证：高、中中和低三个个浓度（与与试剂盒说说明书中所所述相适应应）临界点的定义同样一份样样本，在多多次重复实实验中各有有50%的几率获得得阳性或阴阴性的结果果时该分析析物的浓度度。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline临界点（CUT-OFF)与试剂盒判判断值（CUT-OFF值）的区别别这里的临界点指的是一个个处于试剂剂检测临界界点的样本浓度，其一旦确确定，是不不变的。试剂盒CUT-OFF值指的是一个个判断某一次测定定结果的由由阴性和阳性性对照信号值值按一定公公式计算出出来的信号值，每次测定定都会有所所差异。(1)CUT-OFF重复性验证证CUT-OFF的重复性（（同时包含含测定下限限的验证）批内变异的的验证批间变异的的验证验证步骤制备足够40次重复检测测的3份样本：分别为处于于临界浓度度、高于临临界浓度20%和低于临界界浓度20%的样本。重复检测样样本40次，确定每每一份样本结果为阳性性和阴性的的百分比。。评价临界浓浓度是否准准确？评价价+20至-20%的浓度范围围是否包含于、位位于或者超超出这种方方法的95%区间？CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuidelineC50是否准确？40次测试C501阳性结果=<13/40(32.5%)不正确>=27/40(67.5%)2阳性结果（14-26）/40（35%-65%）正确阳性结果重复性检测总次数次数百分比真正百分比样本的实际浓度201050%30%-70%C30-C70402050%35%-65%1005050%40%-60%不同C50重复检测次数数与检出阳阳性数的关系系临界点（CUT-OFF）的重复性指指的是什么？？是为正在评价的检测试剂或系统建立分析物的的临界浓度(C50)，并且确保临临界浓度±20%的范围处于95%区间内。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline如何获得系统统或试剂的“临界点”检测试剂或系系统的说明书可能会会注明分析物物的临界浓度度。如果临界浓度度未知，则可以将阳性样样本进行一系系列稀释，然然后将他们进进行重复检测测以确定能够够获得50%阳性和50%阴性结果的那那个稀释度。。这一稀释度度的分析物浓浓度即为临界点。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline(2)测定下限的验验证处于测定下限限浓度（如临临界点浓度+20%）的样本，重重复检测20次，应至少有有18次以上(>90%)为阳性反应。。重复性验证的的质量控制质控品：如方方法学比较在在10天内完成，则每一批次都都要进行质控样本检测，如出现失控，，则当次检测测结果无效。。安排重新检测以替换不不合格的批次次。实验室要要分析失控的原因。不不合格批次在在10天内不应超过1次或20天内不超过两两次。如若超出，，所在实验室室应中止检测测工作并咨询询试剂制造商商以确定原因因并采取纠正正措施。得出20次重复检测结果。如果方方法比较研究究超过20天，则每一批批次对每份对对照样本进行行单次检测，，总计也提供供20次结果。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline6.其他（1）同一项目不不同检测方法法或仪器的比比对适用范围:一个项目有两两种以上的方方法或者两台台以上的仪器器(包括同一型号号的仪器)同时检测,需要进行一致致性比对。（注：定量检检测中,报告单位不同同的不需要比比对）首次比对选取取40份(20)样本,最好阴阳性各各半↓随机每8份分成一组↓两种方法(或两台仪器)每天平行检测测一组样本↓将所有检测结结果汇总↓Kappa检验,评价一致性新鲜患者血清清阴性2例，，阳性3例，，阳性包含有有S/CO高高、中、低值值，用新旧批批号试剂检测测。低值避开“灰灰区”夹心法：S/CO低值1.2－3竞争法：S/CO低值0.4－0.6判断标准：符符合率为100%为可接接受。（2）更换批号的的简易比对：：（3）编制性能验验证的SOP理想的操作方方法：操作中影响测测定结果的关关键环节已知知；具有可操作性性的SOP。怎样编写SOP？XXX单位XXX实验室XXX标准操作程序编号：启用日期：版本：第页共页一目的：适用范围：职责或责任人：（方法原理）（检测设备和试剂）（所需的环境条件）操作步骤：

1．

2．

3．。。。。。八、本操作程序变动程序：九、相关的文件十、相关的记录表格和报告编写人审核人批准人（4）试剂的性能能验证（定定性）重复性和准确确性测定下限(Detectionlimit)（定性）批内变异(<10%)和批间变异(<15-25%)“钩状”效应(Hookeffect)变异体的检测测能力(如：HBsAg)临床敏感性和和特异性抗干扰能力三.性能验证的注注意事项1.方法比较持续时间10~20天。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline2.数据收集的检检查每次实验，应应立即记录所所有原始检测测数据并复核核，以早期发发现分析系统统及人为误差差的来源。一旦发现某些些结果是由可可解释的误差差引起的，则则应将其记录录下来，同时时，这些结果果不能用于数数据分析。如不能确定误误差产生的原原因，则保留留原始结果。3.不一致结果的的处理如果比较方法不是是100%准确，可以用用“金标准”“参考方法”来检测在检测测和比较方法法间产生差异异的样本。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline4.参考血清盘曾经被检测过过的、或者被被成熟方法检测的，或临床诊诊断中有意义义的临床样本对于评价定性性方法来说很很有价值。阳性样本浓度度高低不等，，具有代表性性。可占整个个血清盘样本本数的50%。阴性样本可含含有干扰物质质。可占整个个血清盘样本本数的