产品无菌检测实操介绍提纲课件

无菌检查实操简介

（——《药典》（2005版）无菌检查的操作简介）

一、无菌检查的基本条件二、常用培养基的制备三、常见样本的处理四、结果判定五、无菌操作流程六、其它说明七、审核提示

无菌检查实操简介

（——《药典》（20一、无菌检查的基本条件

人机料法环一、无菌检查的基本条件

人机料法环

人：经过培训、授权

建立无菌概念、微生物专业知识，并经过无菌技术培训。熟知对相关产品的无菌检查要求和相关作业指导书熟练填写建立的记录表单.谁能授权？人：经过培训、授权谁能授权？机：主要设备水浴箱高压蒸汽灭菌器天平培养箱100级洁净工作区机：主要设备水浴箱高压蒸汽灭菌器天平培养箱100级洁净工作区

恒温水浴箱

保持营养琼脂培养基处于液体状态（约45℃），需要大量制作培养皿时使用。室温时热溶时营养琼脂

恒温水浴箱

保持营养琼脂培养基处于液体状态（约45℃），

培养箱

（生物培养箱）

普通：仅有升温控制。后者：设计有升温和降温的双向控制装置。二台温度(23~28℃、30~35℃)南方高温天气（35度）时霉菌培养的控制？箱内的温度均衡性？

超净工作台生物安全柜

作用：提供100级单向流空气区。作用效果：防止被操作物（检品）被污染。作用：提供隔离系统（多气流方向）。作用：防止检品、操作人、环境被污染。超净工作台生物安全柜作用：提供1超净工作台整体设计普通层流超净工作台内的气流最终直接对着操作者而排向周围环境。因此，此类净化工作台不得用于处理感染性物品、有毒物品或敏感物品等。它们只适用一般性的无菌操作活动，如无菌物品的装配、常规物品的微生物检查、培养基的制备等。超净工作台整体设计普通层流超净工作台内的气流最终直接对着操作生物安全柜的整体设计生物安全柜的整体设计生物安全柜的用途专用于常规性微生物菌种的处理，如微生物的鉴别、生物指示剂的制备与培养、阳性对照或培养基灵敏度检查用标准菌株的制备、保藏和使用等。实验室如果配备一台净化工作台最好是生物安全柜。生物安全柜的用途专用于常规性微生物菌种的处理，如微生物的鉴别无菌操作中使用的灭菌器

以火焰为中心点可形成近10cm直径的“无菌区”。酒精灯只可在单气流的环境中使用

可在单向气流或多向气流的环境中使用

金属用具、每次重复使用前的快速处理红外线热能灭菌器.doc电子火焰灭菌器.doc无菌操作中使用的灭菌器金属用具、每次重复使用前的快速处理红物品：确认适宜培养基阳性对照菌检品其它酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。物品：确认适宜培养基阳性对照菌法：文件和记录操作规程无菌检验规程（作业指导书）抽样规程产品注册标准超净工作台的维护保养规程《中国药典》（2005年版）GB14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准记录表单《无菌检验原始记录》《菌种外购、转种记录》《培养基制备记录》《实验中废弃的带菌物品灭菌处理记录》《实验用稀释液、冲洗液、缓冲液制备记录》《浓菌液制备使用记录》《洁净区域净化系统运行记录》法：文件和记录操作规程无菌检验规程（作业指导书）抽样规程产抽样的规定（药典2005版）表1批出厂产品最少检验数量供试品批产量N（个）每种培养基最少检验数量注射剂大体积注册剂(＞100ml)≤100100＜N≤500＞50010%或4个（取较多者）10个2%或20个（取较少者）2%或10个（取较少者）眼用及其他非注射产品≤200＞2005%或2个（取较多者）10个桶装固体原料抗生素原料药（≥5g）≤44＜N≤50＞500每个容器20%或4个容器（取较大者）2%或10个容器（取较大者）6个容器医疗器具≤100100＜N≤500＞50010%或4个（取较多者）10个2%或20个（取较少者）注：若每个容器中的装量不足接种两种培养基，那么表中的检验数量加倍.抽样的规定（药典2005版）表1批出厂产品最少抽样的规定（药典2005版）表2上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量供试品装量V（ml）每支样品接入每管培养基的最少样品量最少检验数量（瓶或支）≤1全量2011＜V＜5半量105≤V＜202ml1020≤V＜505ml1050≤V＜10010ml1050≤V＜100（静脉给药）半量10100≤V＜500半量6V≥500500ml61

每种培养基各接种10支供试品抽样的规定（药典2005版）表2上市抽验样品（液体制剂）的最抽样的规定（药典2005版）表3上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量供试品装量M/支、瓶、个每支样品接入每管培养基的最少样品量最少检验数量（瓶或支）M＜50mg50mg≤M＜300mg300mg≤M＜5gM≥5g外科用敷料棉花及纱布缝合线、一次性医用材料带导管的一次性医疗器械（如输液袋）其他医疗器具全量半量150mg500mg取100mg或1cm×3cm整个材料③整个器具③（切碎或拆散）20①101010②1020①1020①每种培养基各接种10支供试品。抗生素粉针剂（≥5g）及抗生素原料（≥5g）的最少检验数量为6瓶或（支），桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。抽样的规定（药典2005版）表3上市抽验样品（固体无菌检验原始记录.doc应记录实现可追溯的基本信息：品名、规格、型号生产批号抽样数量灭菌批号培养基的名称培养基的配制批号培养基的接种数量培养温度检查方法检查日期培养过程的观察记录阳性对照菌的名称设备编号检查结果检查人无菌检验原始记录.doc应记录实现可追溯的基本信息：培养温度操作环境在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行.其全过程应严格

遵守无菌操作,

防止微生物污染。注意鞋套与裤脚的连接操作环境在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向环境控制单向流空气区、工作台面及环境（10000级）必须进行洁净度验证。验证依据：《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》日常：—对试验环境进行监控—维护过程中使用不脱落颗粒物的专业擦拭毛巾、地拖。—不同洁净区，分别专用。超净工作台清洁标准操作规程.doc100级洁净区的管理要求.doc

专业地拖环境控制单向流空气区、工作台面及环境（10000级）必须进行环境控制

在洁净区内，如条件许可，尽量使层流净化工作台始终处于运行状态。一旦停止运行而重新启动后，要对工作区进行彻底性消毒并且在使用前至少要预运行5min。此外，在每次使用前和使用后，均应对工作台面采取清洁和消毒措施。常用的消毒剂：乙醇、碘伏、新洁尔灭。

注意有效性（抗菌谱、有效浓度、干扰因素）常用消毒剂.doc工作区表面灭菌：紫外线照射。（能被普通的纸、玻璃阻挡）环境控制

在洁净二、常用培养基的制备

制备的方式有以下三种：自配培养基购买半成品脱水培养购买成品培养基目前最常见的方式二、常用培养基的制备

制备的方式有以下三种常用培养基的形态：二种固体（营养琼脂）斜面培养皿（平板）斜面：将培养基试管倾斜放置，凝固后即成。常用培养基的形态：二种固体（营养琼脂）斜面培养皿（平板）斜面培养基的种类依据用途划分1、无菌检查和测定菌数用培养基

2、增菌、运送用培养基3、分离培养用培养基

4、鉴别用培养基

5、抗生素检定用培养基6、其它类培养基（生芽孢琼脂斜面培养基）培养基的种类依据用途划分常用的无菌检查脱水培养基编号

品

名

用

途A1硫乙醇酸盐流体培养基好氧菌、厌氧菌培养A2改良马丁培养基真菌培养A3选择性培养基（A1/A2+中和剂或表面活性剂）磺胺类、非水溶性供试品的无菌检查A4营养肉汤培养基细菌总数测定及一般细菌培养A5营养琼脂培养基细菌总数测定及一般细菌培养A60.5%葡萄糖肉汤培养基需气菌无菌试验A7改良马丁琼脂培养基生物制品真菌无菌试验A80.1%蛋白胨水溶液稀释液、冲洗液A9氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0）稀释液、冲洗液常用的无菌检查脱水培养基

A1硫乙醇常用培养基的配方A1.硫乙醇酸盐流体培养基酪腖（胰酶水解）15.0g氯化钠2.5g葡萄糖5.0g新配制的0.1%刃天L-胱氨酸0.5g青溶液1.0ml硫乙醇酸钠0.5g琼脂0.75g（或硫乙醇酸）0.3ml水1000ml酵母浸出粉5.0gPH=7.1±0.2.30℃~35℃。常用培养基的配方酪腖（胰酶水解）15.0g氯化钠2.5g葡萄硫乙醇酸盐流体培养基培养厌氧菌的原理：在液体中加入了0.05%~0.07%的琼脂，增加了培养基的粘度，降低培养基中氧含量，使培养基在一定的时间内保持厌氧的条件，利于厌氧菌的生长。红色氧化层：需氧菌生长层硫乙醇酸盐流体培养基培养厌氧菌的原理：红色氧化层：需氧菌生长

常用培养基的配方

A2.改良马丁培养基

腖5.0g磷酸氢二钾1.0g酵母浸出粉5.0g硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g水1000mlPH=6.4±0.2.23℃~28℃。

常用培养基的配方

常用培养基的配方

A3.选择性培养基

在上A1、A2二种培养基增加：中和剂：对氨基苯甲酸表面活性剂：聚山梨脂80、

β-内酰胺酶A4.营养肉汤培养基腖10.0g氯化钠5.0g牛肉浸出粉3.0g水1000ml

常用培养基的配方

A3.选择性培养基A4.营养肉常用培养基的配方A5.营养琼脂培养基肉汤1000ml琼脂14.0gA7.改良马丁琼脂培养基改良马丁肉汤1000ml琼脂14.0gA6、0.5%葡萄糖肉汤培养基蛋白胨10g氯化钠5.0g葡萄糖5.0g水1000ml牛肉浸出粉3.0gPH=7.2±0.2常用培养基的配方A5.营养琼脂培养基肉汤1000ml琼脂1其它脱水培养基编号

品

名

用

途A8胰酪胨大豆肉汤培养基需气菌和真菌无菌试验A9真菌培养基真菌无菌试验A10真菌琼脂培养基真菌无菌试验A11支原体半流体基础培养基（100g）生物制品支原体检查A12血琼脂基础培养基血琼脂斜面和平板配制A13玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）真菌总数测定A14酵母浸出粉葡萄糖琼脂培养基（YPD琼脂培养基）酵母菌总数测定其它脱水培养基编号

品

名

培养基制备流程图调PH值分装包扎封口称量灭菌加热溶解培养基制备流程图调PH值分装包扎称量灭菌加热溶解培养基制备流程图说明：按以上培养基的配方称取各组分后，充分溶解（必要时加热），分装试管（或其它适合的容器）后，包扎封口（应可通气）、高压蒸汽灭菌。备用。

PH的调节方法：比色（胶体溶液）或生物型

普通PH计：适用离子溶液培养皿（俗称平板）：需要在灭菌后无菌分装；培养基制备流程图说明：培养皿制备：无菌分装皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，应倒置存放、培养，以避免菌落蔓延生长。培养皿制备：无菌分装皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，应倒置存培养基的配制的质量控制灭菌：115℃灭菌30分钟。培养基的装量：约为试管或容器高度的2/5。

制备中灭菌指示剂培养基的配制的质量控制灭菌：115℃灭菌30分钟。培养基的装灭菌指示剂（生物型+化学型）

生物指示剂指示剂：培养后生物指示剂中的溴甲酚紫培养液由紫色澄清液体变为黄色澄清液体即表示有菌生长，判定为灭菌不合格；培养液仍为紫色澄清液体为无菌生长，同时阳性对照管中的嗜热脂肪杆菌生长正常即培养液由紫色澄清液体变为黄色澄清液体，判定为灭菌合格。嗜热芽孢压力蒸汽灭菌生物指示剂.doc化学指示卡：由特殊卡纸、标准色块和指示色块组成压力蒸汽灭菌化学指示卡。指示色块由淡黄色变为灰黑色或黑色，即指示灭菌处理达到合格要求。灭菌化学指示卡和胶带.doc灭菌指示胶带：

是一种过程指示器材（是否经过压力蒸气灭菌的标识）。在温度达到115℃以上时，条纹状油墨发生化学变化并伴随颜色变化。灭菌指示剂（生物型+化学型）

生物指示剂指示剂：培养后生物指

培养基的配制的质量控制

每批抽样：不少于5支。细菌培养基经30～35℃培养14天,应无菌生长。真菌培养基经23～28℃培养14天，应无菌生长。观察灭菌指示剂（呈阴性色）通过培养基灵敏度检查法。

灭菌后

培养基的配制的质量控制

每批抽样：不少于5支。

培养基灵敏度检查法

——目的：证明配置的培养基是适合相应的微生物生长。证明检查结果的准确、有效。可以与无菌检查同时进行。

菌株(1)藤黄微球菌(Micrococcus

Luteus)[CMCC(B)2800(2)生孢梭菌(Clostridium

sporogenes)[CMCC(B)64941]

(3)白色念珠菌(Candida

albicans)[CMCC(F)98001]等6株接种量

1ML(10~100个菌/ML)上述菌液接种于各培养基

各3支，每支培养基装量9ml或12ml。判定以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。

培养基灵敏度检查法

——目的：证明配置的培养基是适合相应试验用菌株的说明*非灵敏度检查用菌。注意：培养时间要求不同试验用菌株的说明*非灵敏度检查用菌。注意：培养时间要求不同

菌株的来源：

菌株的来源：

菌株的来源：菌株的来源：菌种的质量控制保藏原理

适当的方式保存。菌种的质量控制保藏原理适当的方式保存。菌株的质量控制传代不能超过5代。菌种传代.doc甘油冷冻管G2斜面：菌种作为工作用菌种G3/W3G0G1G2甘油冷冻管G4纯度、理化签定后挑取纯菌落甘油冷冻管G3斜面：菌种作为工作用菌种G4/W4G4G3G5斜面：菌种作为工作用菌种G5/W5甘油冷冻管G5菌株的质量控制传代不能超过5代。菌种传代.doc甘油冷冻管G

提示：——培养基的灵敏度检查法是一项对微生物专业要求较高的操作技术。目前多数企业都不具备作该试验的技术人员，目前比较普通做法是购买有资质的脱水培养基（如中检所），同时要求制造商提供有关报告。自己不做该检查。——如果培养基在有效期内没有用完，在继续使用前应再次验证其培养灵敏度。培养基灵敏度检查法.doc

提示：——培养基的灵敏度检查法是一项对微生物专业要求较高的培养基的配制的质量控制

2~25℃、避光。有效期：非密闭3周，密闭1年。硫乙醇酸盐流体培养基使用培养前，培养基的氧化层（粉色层）不超过液面高度1/5。否则,须经水浴煮沸加热（不超过20分钟）,

迅速冷却，只限加热一次。培养结束后培养基的氧化层（粉色层），不超过液面高度的1/2。保存使用后培养基的配制的质量控制2~25℃、避光。保存使用后

成品培养基

规模化生产细菌培养基节省时间和制备成本没有灰尘、粉尘对环境的影响良好的批量一致性和可追溯性保存：2~25℃、避光。有效期：非密闭3周，密闭1年。液体培养基优势

成品培养基

规模化生产细菌培养基保存三、常见样本的处理无菌检查法薄膜过滤法适用于液体制剂和可溶性固体制剂及有抗菌作用的供试品；原理：供试液通过滤膜，将菌集留在膜上，将滤膜放置在有营养的基质中，经培养，微生物增长，形成菌落。直接接种法适用于非抗菌作用的供试品；固体供试品；三、常见样本的处理无菌检查法薄膜过滤法适用于液体制剂和可溶性三、常见样本的处理方法验证试验目的：证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查（测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用）。试验的时机：1）建立产品的无菌检查方法时。

2）产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证范围：

对每一试验菌应逐一进行验证。方法：

检品+灵敏度检测试验菌+培养基=》试验菌生长良好。无菌检查方法验证试验.docx三、常见样本的处理方法验证试验无菌检查和验证示例产品：纳米银离子敷料，规格6cm×7cm，包装规格：1片/袋验证试验：培养基15ml/支，剪取1片样品（1cm×3cm），直接接种硫乙醇培养基4支、改良马丁2支，再加入6株阳性菌。表：样品对6株阳性菌的试验结果无菌检查和验证示例产品：纳米银离子敷料，规格6cm×7cm，结果分析：该检验量对26003（金黄色葡萄球菌）有抑制作用。

解决方法：增加培养基用量。

表：样品对26003的再次验证再验证结果分析：

纳米银离子敷料，该检测量在该条件下无抑菌作用或者其抑菌作用可以忽略不计。验证结论：

纳米银离子敷料的无菌检查方法是取样品10袋、培养基40ml/支，每支培养基接种量1cm×3cm，培养14天。数量依据表3确定结果分析：该检验量对26003（金黄色葡萄球菌）有抑制作用。三、常见样本的处理

1、液体样品：薄膜过滤法药典推荐使用全封闭的系统进行检查。目前已商品化的产品：

集菌仪

实物展示、培养器（滤筒）结构说明

滤膜孔径：0.45μm滤膜直径：50mm

三、常见样本的处理

1、液体样品：薄膜过滤法集菌仪工作原理图示集菌仪工作原理图示三、常见样本的处理两种培养基的接种支/瓶数之比为2：1无菌检查的阳性阴性对照设置.docx改良马丁培养基1支（100ml/支）硫乙醇酸盐培养基2支（100ml/支）薄膜过滤法的接种数量其中1支在培养14天后，加入阳性对照菌阴性对照：使用相应的溶剂、稀释液和冲洗液同法操作。三、常见样本的处理两种培养基的接种支/瓶数之比为2：1改良马其它细菌过滤器接真空泵增加过滤速度其它细菌过滤器接真空泵增加过滤速度微生物过滤膜常用孔径：除菌--0.22μm集菌--0.45μm不同溶液可选择不同的截流效果膜微生物过滤膜常用孔径：除菌--0.22μm不同溶液可选择不同阳性对照菌的使用供试产品对照阳性菌编号无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的供试品，金黄色葡萄球菌26003抗革兰氏阴性菌为主的供试品大肠埃希氏菌44102抗厌氧菌的供试品生孢梭菌64941抗真菌的供试品白色念球菌98001*使用的菌液浓度 <100cfu/ml。阳性对照菌的使用供试产品对照阳性菌编号无抑菌作用及抗革兰氏阳对照菌液的制备

——同培养基灵敏度检查的菌液制备标准菌株G3/W3对照菌液的制备

——同培养基灵敏度检查的菌液制备标准菌株G3对照菌液的制备

使用的菌液浓度：10~100cfu/ml对照菌液的制备

菌落计数2）、在营养琼脂培养皿上计算菌落数。每个菌堆积点算一个菌。1）、菌液稀释后可直接与细菌标准浓度比浊管比较。菌落计数2）、在营养琼脂培养皿上计算菌落数。每个菌堆积点算一三、常见样本的处理2、固体样品：

直接接种法三、常见样本的处理2、固体样品：直接接种法固体样品检查应注意的事项样品的要求完整：最小包装完好、没有任何污染、破损。有效：名称、地址、批号、规格型号。

*样品检验前的处理：信息、脱去外包装、标记编号。用适宜的消毒液对其外表面进行消毒、紫外线照射。*培养基硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基接种支/瓶数之比为2：1。供试品体积不得大于培养基体积的

10%。硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于

15ml。改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。固体样品检查应注意的事项样品的要求*样品检验前的处理：三、常见样本的处理3、表面有活性剂、中和剂或灭活剂、抗菌作用的供试品:薄膜过滤法

检查前应证明检查方法的有效性及对微生物的生长无影响。抑细菌和抑真菌试验.docx

供试品具有抑菌作用或含防腐剂时，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次。每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验4、其它产品复溶、清洗：将复溶液、清洗液按薄膜过滤法进行。三、常见样本的处理3、表面有活性剂、中和剂或灭活剂、抗菌作用2005版药典明确检验方法的IVDD产品薄膜过滤法直接接种法具有导管的医疗器具：输血、输液袋*每个最小包装用50~100ml冲洗液内壁后过滤配带的针头敷料*不同部位剪取约1cm×3cm肠线、缝合线等*用最小包装接种灭菌医用器具等拆散或切成小碎段2005版药典明确检验方法的IVDD产品薄膜过滤法直接接种法培养及观察逐日观察并记录是否有菌生长23℃~28℃：改良马丁培养基1份30℃~35℃：硫乙醇酸盐培养基2份、培养14天后培养及观察逐日观察并记录是否有菌生长23℃~28℃：30四、结果判定判定方法逐日观看任何一管培养基是否保持透明（阴性）、或出现浑浊、絮状物（阳性）。对照菌液的生长（细菌在24小时内应有菌生长，真菌应在培养24～72小时有菌生长。）四、结果判定判定方法培养及观察培养

14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养

2天、真菌培养

3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时作菌种鉴定。培养及观察培养14天后，不能从外观上判断有无细菌转种的器具、分离细菌转种的器具、分离结果判定当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：⑴无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。⑶

阴性对照管有菌生长。(4)供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。

结果判定当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：五、无菌检查操作流程取样、物品、环境准备清洁产品外包装转入工作区无菌操作样品接种（直接接种或薄膜过滤法）培养观察判定五、无菌检查操作流程取样、物品、环境准备清洁产品外包装转入工无菌操作流程一盏酒精灯，以火焰为中心点可形成近10cm直径的“无菌区”。无菌操作流程一盏酒精灯，以火焰为中心点可形成近10cm直径的六、其它说明微生物学检验无菌检查微生物限度检验细菌、真菌数量控制菌其它六、其它说明微生物学检验无菌检查微生物限度检验细菌、真菌数

六、其它说明

检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。(要求：每平皿<1CFU)无菌检查的培养时间：7天？《药典》2000版2005版药典是14天。产品检测工作区与阳性对照菌接种区是否应分开？（2005版药典未明确？各检测中心是分设的）

六、其它说明

检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼

（2010版药典？2010.7.1生效）

表1:出厂制品不同规格及原液和半成品最少抽验数量

供试品批产量(N)；装量（V）最少抽验数量注射剂N≤1005个100＜N≤50010个N＞50020个冻干血液制品V＞5ml每柜冻干N≤200个5个每柜冻干N＞200个10个V≤5mlN≤1005个100＜N≤50010个N＞50020个原液或半成品每个容器取样，取样量为每个容器制品总量的0.1%或不少于10ml。每开瓶一次，应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每批抽验量应不少于3ml。

（2010版药典？2010.7.1生效）

表1:（2010版药典？）

表2：上市制品监督抽验数量

品种及装量（V）最少抽验数量血液制品

V＜50ml6个V≥50ml2个其他生物制品10个（2010版药典？）

表2：上市制品监督抽验数量

品种及装量（2010版

药典？）

表3:不同规格制品的最少接种量

规格每支（瓶）供试品的最少接种量液体制剂（ml）≤1全量1＜V≤5半量5＜V＜202ml20≤V＜5010mlV≥50半量原液或半成品半量固体制剂＜50mg全量50mg≤M＜300mg半量300mg≤M＜150mgM≥半量（2010版药典？）

表3:不同规格制品的最少接种量2010版药典的变化：培养基的灭菌检查数量：=》不少于10支。培养基的灭菌条件：115℃灭菌30分钟=》验证合格的灭菌程序灭菌。直接接种的数量：？未明确2010版药典的变化：七、审核提示文件：1）是否编制了作业文件和相适应的记录？有否包括检验方法的验证？2）检验范围是否包括了需-厌氧细菌和霉菌、真菌（有的企业自己做无菌检查，但不知道要检查二类菌）3）使用的培养基是否适合、是否有灵敏度检查记录或报告？（有的企业使用的即不是硫乙醇酸盐培养基、也不是马丁培养基）记录1）是否能够反映IVDD要求追溯的内容：品名、部件名称、批号、灭菌批号、培养条件（培养基名称、培养温度、接种方式、接种数量等）、培养过程的逐日记录。2）培养基配制记录、阳性菌的使用记录？

（企业的记录常常不全、菌株没有传代记录、不用阳性菌)3）实际应用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。设备、设施1）培养箱的数量（2台）、能否将温度控制在23-28℃？2）集菌仪？（并非所有生产无菌产品的企业均适用）pH计？3）无菌检查环境和工作区是否符合要求？医疗器械产品无菌检验操作规程.doc无菌检验原始记录.doc七、审核提示文件：谢谢！产品无菌检测实操介绍提纲课件

无菌检查实操简介

（——《药典》（2005版）无菌检查的操作简介）

一、无菌检查的基本条件二、常用培养基的制备三、常见样本的处理四、结果判定五、无菌操作流程六、其它说明七、审核提示

无菌检查实操简介

（——《药典》（20一、无菌检查的基本条件

人机料法环一、无菌检查的基本条件

人机料法环

人：经过培训、授权

建立无菌概念、微生物专业知识，并经过无菌技术培训。熟知对相关产品的无菌检查要求和相关作业指导书熟练填写建立的记录表单.谁能授权？人：经过培训、授权谁能授权？机：主要设备水浴箱高压蒸汽灭菌器天平培养箱100级洁净工作区机：主要设备水浴箱高压蒸汽灭菌器天平培养箱100级洁净工作区

恒温水浴箱

保持营养琼脂培养基处于液体状态（约45℃），需要大量制作培养皿时使用。室温时热溶时营养琼脂

恒温水浴箱

保持营养琼脂培养基处于液体状态（约45℃），

培养箱

（生物培养箱）

普通：仅有升温控制。后者：设计有升温和降温的双向控制装置。二台温度(23~28℃、30~35℃)南方高温天气（35度）时霉菌培养的控制？箱内的温度均衡性？

超净工作台生物安全柜

作用：提供100级单向流空气区。作用效果：防止被操作物（检品）被污染。作用：提供隔离系统（多气流方向）。作用：防止检品、操作人、环境被污染。超净工作台生物安全柜作用：提供1超净工作台整体设计普通层流超净工作台内的气流最终直接对着操作者而排向周围环境。因此，此类净化工作台不得用于处理感染性物品、有毒物品或敏感物品等。它们只适用一般性的无菌操作活动，如无菌物品的装配、常规物品的微生物检查、培养基的制备等。超净工作台整体设计普通层流超净工作台内的气流最终直接对着操作生物安全柜的整体设计生物安全柜的整体设计生物安全柜的用途专用于常规性微生物菌种的处理，如微生物的鉴别、生物指示剂的制备与培养、阳性对照或培养基灵敏度检查用标准菌株的制备、保藏和使用等。实验室如果配备一台净化工作台最好是生物安全柜。生物安全柜的用途专用于常规性微生物菌种的处理，如微生物的鉴别无菌操作中使用的灭菌器

以火焰为中心点可形成近10cm直径的“无菌区”。酒精灯只可在单气流的环境中使用

可在单向气流或多向气流的环境中使用

金属用具、每次重复使用前的快速处理红外线热能灭菌器.doc电子火焰灭菌器.doc无菌操作中使用的灭菌器金属用具、每次重复使用前的快速处理红物品：确认适宜培养基阳性对照菌检品其它酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。物品：确认适宜培养基阳性对照菌法：文件和记录操作规程无菌检验规程（作业指导书）抽样规程产品注册标准超净工作台的维护保养规程《中国药典》（2005年版）GB14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准记录表单《无菌检验原始记录》《菌种外购、转种记录》《培养基制备记录》《实验中废弃的带菌物品灭菌处理记录》《实验用稀释液、冲洗液、缓冲液制备记录》《浓菌液制备使用记录》《洁净区域净化系统运行记录》法：文件和记录操作规程无菌检验规程（作业指导书）抽样规程产抽样的规定（药典2005版）表1批出厂产品最少检验数量供试品批产量N（个）每种培养基最少检验数量注射剂大体积注册剂(＞100ml)≤100100＜N≤500＞50010%或4个（取较多者）10个2%或20个（取较少者）2%或10个（取较少者）眼用及其他非注射产品≤200＞2005%或2个（取较多者）10个桶装固体原料抗生素原料药（≥5g）≤44＜N≤50＞500每个容器20%或4个容器（取较大者）2%或10个容器（取较大者）6个容器医疗器具≤100100＜N≤500＞50010%或4个（取较多者）10个2%或20个（取较少者）注：若每个容器中的装量不足接种两种培养基，那么表中的检验数量加倍.抽样的规定（药典2005版）表1批出厂产品最少抽样的规定（药典2005版）表2上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量供试品装量V（ml）每支样品接入每管培养基的最少样品量最少检验数量（瓶或支）≤1全量2011＜V＜5半量105≤V＜202ml1020≤V＜505ml1050≤V＜10010ml1050≤V＜100（静脉给药）半量10100≤V＜500半量6V≥500500ml61

每种培养基各接种10支供试品抽样的规定（药典2005版）表2上市抽验样品（液体制剂）的最抽样的规定（药典2005版）表3上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量供试品装量M/支、瓶、个每支样品接入每管培养基的最少样品量最少检验数量（瓶或支）M＜50mg50mg≤M＜300mg300mg≤M＜5gM≥5g外科用敷料棉花及纱布缝合线、一次性医用材料带导管的一次性医疗器械（如输液袋）其他医疗器具全量半量150mg500mg取100mg或1cm×3cm整个材料③整个器具③（切碎或拆散）20①101010②1020①1020①每种培养基各接种10支供试品。抗生素粉针剂（≥5g）及抗生素原料（≥5g）的最少检验数量为6瓶或（支），桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。抽样的规定（药典2005版）表3上市抽验样品（固体无菌检验原始记录.doc应记录实现可追溯的基本信息：品名、规格、型号生产批号抽样数量灭菌批号培养基的名称培养基的配制批号培养基的接种数量培养温度检查方法检查日期培养过程的观察记录阳性对照菌的名称设备编号检查结果检查人无菌检验原始记录.doc应记录实现可追溯的基本信息：培养温度操作环境在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行.其全过程应严格

遵守无菌操作,

防止微生物污染。注意鞋套与裤脚的连接操作环境在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向环境控制单向流空气区、工作台面及环境（10000级）必须进行洁净度验证。验证依据：《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》日常：—对试验环境进行监控—维护过程中使用不脱落颗粒物的专业擦拭毛巾、地拖。—不同洁净区，分别专用。超净工作台清洁标准操作规程.doc100级洁净区的管理要求.doc

专业地拖环境控制单向流空气区、工作台面及环境（10000级）必须进行环境控制

在洁净区内，如条件许可，尽量使层流净化工作台始终处于运行状态。一旦停止运行而重新启动后，要对工作区进行彻底性消毒并且在使用前至少要预运行5min。此外，在每次使用前和使用后，均应对工作台面采取清洁和消毒措施。常用的消毒剂：乙醇、碘伏、新洁尔灭。

注意有效性（抗菌谱、有效浓度、干扰因素）常用消毒剂.doc工作区表面灭菌：紫外线照射。（能被普通的纸、玻璃阻挡）环境控制

在洁净二、常用培养基的制备

制备的方式有以下三种：自配培养基购买半成品脱水培养购买成品培养基目前最常见的方式二、常用培养基的制备

制备的方式有以下三种常用培养基的形态：二种固体（营养琼脂）斜面培养皿（平板）斜面：将培养基试管倾斜放置，凝固后即成。常用培养基的形态：二种固体（营养琼脂）斜面培养皿（平板）斜面培养基的种类依据用途划分1、无菌检查和测定菌数用培养基

2、增菌、运送用培养基3、分离培养用培养基

4、鉴别用培养基

5、抗生素检定用培养基6、其它类培养基（生芽孢琼脂斜面培养基）培养基的种类依据用途划分常用的无菌检查脱水培养基编号

品

名

用

途A1硫乙醇酸盐流体培养基好氧菌、厌氧菌培养A2改良马丁培养基真菌培养A3选择性培养基（A1/A2+中和剂或表面活性剂）磺胺类、非水溶性供试品的无菌检查A4营养肉汤培养基细菌总数测定及一般细菌培养A5营养琼脂培养基细菌总数测定及一般细菌培养A60.5%葡萄糖肉汤培养基需气菌无菌试验A7改良马丁琼脂培养基生物制品真菌无菌试验A80.1%蛋白胨水溶液稀释液、冲洗液A9氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0）稀释液、冲洗液常用的无菌检查脱水培养基

A1硫乙醇常用培养基的配方A1.硫乙醇酸盐流体培养基酪腖（胰酶水解）15.0g氯化钠2.5g葡萄糖5.0g新配制的0.1%刃天L-胱氨酸0.5g青溶液1.0ml硫乙醇酸钠0.5g琼脂0.75g（或硫乙醇酸）0.3ml水1000ml酵母浸出粉5.0gPH=7.1±0.2.30℃~35℃。常用培养基的配方酪腖（胰酶水解）15.0g氯化钠2.5g葡萄硫乙醇酸盐流体培养基培养厌氧菌的原理：在液体中加入了0.05%~0.07%的琼脂，增加了培养基的粘度，降低培养基中氧含量，使培养基在一定的时间内保持厌氧的条件，利于厌氧菌的生长。红色氧化层：需氧菌生长层硫乙醇酸盐流体培养基培养厌氧菌的原理：红色氧化层：需氧菌生长

常用培养基的配方

A2.改良马丁培养基

腖5.0g磷酸氢二钾1.0g酵母浸出粉5.0g硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g水1000mlPH=6.4±0.2.23℃~28℃。

常用培养基的配方

常用培养基的配方

A3.选择性培养基

在上A1、A2二种培养基增加：中和剂：对氨基苯甲酸表面活性剂：聚山梨脂80、

β-内酰胺酶A4.营养肉汤培养基腖10.0g氯化钠5.0g牛肉浸出粉3.0g水1000ml

常用培养基的配方

A3.选择性培养基A4.营养肉常用培养基的配方A5.营养琼脂培养基肉汤1000ml琼脂14.0gA7.改良马丁琼脂培养基改良马丁肉汤1000ml琼脂14.0gA6、0.5%葡萄糖肉汤培养基蛋白胨10g氯化钠5.0g葡萄糖5.0g水1000ml牛肉浸出粉3.0gPH=7.2±0.2常用培养基的配方A5.营养琼脂培养基肉汤1000ml琼脂1其它脱水培养基编号

品

名

用

途A8胰酪胨大豆肉汤培养基需气菌和真菌无菌试验A9真菌培养基真菌无菌试验A10真菌琼脂培养基真菌无菌试验A11支原体半流体基础培养基（100g）生物制品支原体检查A12血琼脂基础培养基血琼脂斜面和平板配制A13玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）真菌总数测定A14酵母浸出粉葡萄糖琼脂培养基（YPD琼脂培养基）酵母菌总数测定其它脱水培养基编号

品

名

培养基制备流程图调PH值分装包扎封口称量灭菌加热溶解培养基制备流程图调PH值分装包扎称量灭菌加热溶解培养基制备流程图说明：按以上培养基的配方称取各组分后，充分溶解（必要时加热），分装试管（或其它适合的容器）后，包扎封口（应可通气）、高压蒸汽灭菌。备用。

PH的调节方法：比色（胶体溶液）或生物型

普通PH计：适用离子溶液培养皿（俗称平板）：需要在灭菌后无菌分装；培养基制备流程图说明：培养皿制备：无菌分装皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，应倒置存放、培养，以避免菌落蔓延生长。培养皿制备：无菌分装皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，应倒置存培养基的配制的质量控制灭菌：115℃灭菌30分钟。培养基的装量：约为试管或容器高度的2/5。

制备中灭菌指示剂培养基的配制的质量控制灭菌：115℃灭菌30分钟。培养基的装灭菌指示剂（生物型+化学型）

生物指示剂指示剂：培养后生物指示剂中的溴甲酚紫培养液由紫色澄清液体变为黄色澄清液体即表示有菌生长，判定为灭菌不合格；培养液仍为紫色澄清液体为无菌生长，同时阳性对照管中的嗜热脂肪杆菌生长正常即培养液由紫色澄清液体变为黄色澄清液体，判定为灭菌合格。嗜热芽孢压力蒸汽灭菌生物指示剂.doc化学指示卡：由特殊卡纸、标准色块和指示色块组成压力蒸汽灭菌化学指示卡。指示色块由淡黄色变为灰黑色或黑色，即指示灭菌处理达到合格要求。灭菌化学指示卡和胶带.doc灭菌指示胶带：

是一种过程指示器材（是否经过压力蒸气灭菌的标识）。在温度达到115℃以上时，条纹状油墨发生化学变化并伴随颜色变化。灭菌指示剂（生物型+化学型）

生物指示剂指示剂：培养后生物指

培养基的配制的质量控制

每批抽样：不少于5支。细菌培养基经30～35℃培养14天,应无菌生长。真菌培养基经23～28℃培养14天，应无菌生长。观察灭菌指示剂（呈阴性色）通过培养基灵敏度检查法。

灭菌后

培养基的配制的质量控制

每批抽样：不少于5支。

培养基灵敏度检查法

——目的：证明配置的培养基是适合相应的微生物生长。证明检查结果的准确、有效。可以与无菌检查同时进行。

菌株(1)藤黄微球菌(Micrococcus

Luteus)[CMCC(B)2800(2)生孢梭菌(Clostridium

sporogenes)[CMCC(B)64941]

(3)白色念珠菌(Candida

albicans)[CMCC(F)98001]等6株接种量

1ML(10~100个菌/ML)上述菌液接种于各培养基

各3支，每支培养基装量9ml或12ml。判定以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。

培养基灵敏度检查法

——目的：证明配置的培养基是适合相应试验用菌株的说明*非灵敏度检查用菌。注意：培养时间要求不同试验用菌株的说明*非灵敏度检查用菌。注意：培养时间要求不同

菌株的来源：

菌株的来源：

菌株的来源：菌株的来源：菌种的质量控制保藏原理

适当的方式保存。菌种的质量控制保藏原理适当的方式保存。菌株的质量控制传代不能超过5代。菌种传代.doc甘油冷冻管G2斜面：菌种作为工作用菌种G3/W3G0G1G2甘油冷冻管G4纯度、理化签定后挑取纯菌落甘油冷冻管G3斜面：菌种作为工作用菌种G4/W4G4G3G5斜面：菌种作为工作用菌种G5/W5甘油冷冻管G5菌株的质量控制传代不能超过5代。菌种传代.doc甘油冷冻管G

提示：——培养基的灵敏度检查法是一项对微生物专业要求较高的操作技术。目前多数企业都不具备作该试验的技术人员，目前比较普通做法是购买有资质的脱水培养基（如中检所），同时要求制造商提供有关报告。自己不做该检查。——如果培养基在有效期内没有用完，在继续使用前应再次验证其培养灵敏度。培养基灵敏度检查法.doc

提示：——培养基的灵敏度检查法是一项对微生物专业要求较高的培养基的配制的质量控制

2~25℃、避光。有效期：非密闭3周，密闭1年。硫乙醇酸盐流体培养基使用培养前，培养基的氧化层（粉色层）不超过液面高度1/5。否则,须经水浴煮沸加热（不超过20分钟）,

迅速冷却，只限加热一次。培养结束后培养基的氧化层（粉色层），不超过液面高度的1/2。保存使用后培养基的配制的质量控制2~25℃、避光。保存使用后

成品培养基

规模化生产细菌培养基节省时间和制备成本没有灰尘、粉尘对环境的影响良好的批量一致性和可追溯性保存：2~25℃、避光。有效期：非密闭3周，密闭1年。液体培养基优势

成品培养基

规模化生产细菌培养基保存三、常见样本的处理无菌检查法薄膜过滤法适用于液体制剂和可溶性固体制剂及有抗菌作用的供试品；原理：供试液通过滤膜，将菌集留在膜上，将滤膜放置在有营养的基质中，经培养，微生物增长，形成菌落。直接接种法适用于非抗菌作用的供试品；固体供试品；三、常见样本的处理无菌检查法薄膜过滤法适用于液体制剂和可溶性三、常见样本的处理方法验证试验目的：证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查（测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用）。试验的时机：1）建立产品的无菌检查方法时。

2）产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证范围：

对每一试验菌应逐一进行验证。方法：

检品+灵敏度检测试验菌+培养基=》试验菌生长良好。无菌检查方法验证试验.docx三、常见样本的处理方法验证试验无菌检查和验证示例产品：纳米银离子敷料，规格6cm×7cm，包装规格：1片/袋验证试验：培养基15ml/支，剪取1片样品（1cm×3cm），直接接种硫乙醇培养基4支、改良马丁2支，再加入6株阳性菌。表：样品对6株阳性菌的试验结果无菌检查和验证示例产品：纳米银离子敷料，规格6cm×7cm，结果分析：该检验量对26003（金黄色葡萄球菌）有抑制作用。

解决方法：增加培养基用量。

表：样品对26003的再次验证再验证结果分析：

纳米银离子敷料，该检测量在该条件下无抑菌作用或者其抑菌作用可以忽略不计。验证结论：

纳米银离子敷料的无菌检查方法是取样品10袋、培养基40ml/支，每支培养基接种量1cm×3cm，培养14天。数量依据表3确定结果分析：该检验量对26003（金黄色葡萄球菌）有抑制作用。三、常见样本的处理

1、液体样品：薄膜过滤法药典推荐使用全封闭的系统进行检查。目前已商品化的产品：

集菌仪

实物展示、培养器（滤筒）结构说明

滤膜孔径：0.45μm滤膜直径：50mm

三、常见样本的处理

1、液体样品：薄膜过滤法集菌仪工作原理图示集菌仪工作原理图示三、常见样本的处理两种培养基的接种支/瓶数之比为2：1无菌检查的阳性阴性对照设置.docx改良马丁培养基1支（100ml/支）硫乙醇酸盐培养基2支（100ml/支）薄膜过滤法的接种数量其中1支在培养14天后，加入阳性对照菌阴性对照：使用相应的溶剂、稀释液和冲洗液同法操作。三、常见样本的处理两种培养基的接种支/瓶数之比为2：1改良马其它细菌过滤器接真空泵增加过滤速度其它细菌过滤器接真空泵增加过滤速度微生物过滤膜常用孔径：除菌--0.22μm集菌--0.45μm不同溶液可选择不同的截流效果膜微生物过滤膜常用孔径：除菌--0.22μm不同溶液可选择不同阳性对照菌的使用供试产品对照阳性菌编号无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的供试品，金黄色葡萄球菌26003抗革兰氏阴性菌为主的供试品大肠埃希氏菌44102抗厌氧菌的供试品生孢梭菌64941抗真菌的供试品白色念球菌98001*使用的菌液浓度 <100cfu/ml。阳性对照菌的使用供试产品对照阳性菌编号无抑菌作用及抗革兰氏阳对照菌液的制备

——同培养基灵敏度检查的菌液制备标准菌株G3/W3对照菌液的制备

——同培养基灵敏度检查的菌液制备标准菌株G3对照菌液的制备

使用的菌液浓度：10~100cfu/ml对照菌液的制备

菌落计数2）、在营养琼脂培养皿上计算菌落数。每个菌堆积点算一个菌。1）、菌液稀释后可直接与细菌标准浓度比浊管比较。菌落计数2）、在营养琼脂培养皿上计算菌落数。每个菌堆积点算一三、常见样本的处理2、固体样品：

直接接种法三、常见样本的处理2、固体样品：直接接种法固体样品检查应注意的事项样品的要求完整：最小包装完好、没有任何污染、破损。有效：名称、地址、批号、规格型号。

*样品检验前的处理：信息、脱去外包装、标记编号。用适宜的消毒液对其外表面进行消毒、紫外线照射。*培养基硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基接种支/瓶数之比为2：1。供试品体积不得大于培养基体积的

10%。硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于

15ml。改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。固体样品检查应注意的事项样品的要求*样品检验前的处理：三、常见样本的处理3、表面有活性剂、中和剂或灭活剂、抗菌作用的供试品:薄膜过滤法

检查前应证明检查方法的有效性及对微生物的生长无影响。抑细菌和抑真菌试验.docx

供试品具有抑菌作用或含防腐剂时，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次。每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验4、其它产品复溶、清洗：将复溶液、清洗液按薄膜过滤法进行。三、常见样本的处理3、表面有活性剂、中和剂或灭活剂、抗菌作用2005版药典明确检验方法的IVDD产品薄膜过滤法直接接种法具有导管的医疗器具：输血、输液袋*每个最小包装用50~100ml冲洗液内壁后过滤配带的针头敷料*不同部位剪取约1cm×3cm肠线、缝合线等*用最小包装接种灭菌医用器具等拆散或切成小碎段2005版药典明确检验方法的IVDD产品薄膜过滤法直接接种法培养及观察逐日观察并记录是否有菌生长23℃~28℃：改良马丁培养基1