外周血单核细胞亚群分布与类风湿关节炎发病相关性

外周血单核细胞亚群分布与类风湿关节炎发病相关性类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种病因未明，发病机制复杂的自身免疫性疾病，关节滑膜组织的慢性炎症性增生、血管翳形成及骨质破坏是其主要的病理特征［1,

2,

3］。单核细胞是机体固有免疫的关键细胞，主要通过吞噬、抗原提呈和分泌细胞因子来发挥其免疫功能，根据单核细胞表面CD14和CD16的差异表达，可将单核细胞分为3种亚型［4］：经典型（classicalmonocytes，CD14++CD16-，CM），中间型（intermediatemonocytes，CD14++CD16+，IM）与非经典型（non-classicalmonocytes，CD14+CD16++，NCM）。有研究显示RA患者外周血单核细胞亚型分布存在异常，并与RA的疾病易感性及疾病活动程度相关［4,

5］。为阐明RA患者外周血单核细胞亚型分布及其功能异常与RA发病的相关性，本研究检测了62例RA患者、52例健康对照（healthycontrol，HC）和12例疾病对照患者外周血单核细胞亚型分布差异，分析了3组间各亚群细胞人白细胞抗原DR（humanleukocyteantigenDR，HLA-DR）表达及促炎症细胞因子肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNF-α）分泌水平差异。对象与方法一、对象1.RA组：2020年6月至2021年12月在同济大学附属东方医院收集62例RA患者，其中男性16例，女性46例，年龄（49.71±13.15）岁。诊断参照2018年中国类风湿关节炎诊疗指南［2］，根据欧洲风湿病联盟推荐的RA疾病活动指数28评分将RA患者分为活动期（18例）和静止期（62例）。

2.疾病对照组：2020年6月至2021年12月在同济大学附属东方医院就诊的患有系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus，SLE）、干燥综合征（Sjogrensyndrome，SS）、强直性脊柱炎等其他自身免疫性疾病的12例患者，其中男性2例，女性10例，年龄（45.50±14.60）岁。

3.健康对照组：2020年6月至2021年12月在同济大学附属东方医院收集健康志愿者52名，其中男性29名，女性23名，年龄（51.71±11.14）岁。

本研究通过本院伦理委员会审批（2016伦审第011号），免除患者知情同意。二、方法1.试剂与仪器：Ficoll-Paque试剂购自美国GEHealthcare公司；胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）购自中国EUROIMMUN公司；CD14-别藻青蛋白（allophycocyanin，APC）、CD16-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）-CY7、HLA-DR-PE、TNF-α-PE、BrefeldinA均购自美国BDPharmingen公司；固定剂A和破膜剂B购自荷兰NordicMubio；十二项细胞因子检测试剂盒购自江西赛基生物技术有限公司。BDFACSCantoⅡ细胞仪（BD公司）；二氧化碳培养箱（海力电科学仪器有限公司）；BeamCyte流式细胞仪（常州必达科有限公司）。

2.临床样本及数据收集：记录研究队列中包括白细胞数、中性粒细胞数、中性粒细胞比例、单核细胞数、单核细胞比例、C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、红细胞沉降率（erythrocytesedimentationrate，ESR）、类风湿因子（rheumatoidfactor，RF）和抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cycliccitrullinatedpeptideantibody，CCP）在内的临床参数，以便进一步分析。收集来自RA、HC和疾病对照的EDTA抗凝血样品和血清。

3.流式细胞术：通过Ficoll-Paque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC），并将其重悬于含有1%FBS的PBS中。将PBMC（5×105个）与抗CD14-APC、CD16-PE-CY7、HLA-DR-PE避光染色20min，并用含1%FBS的PBS洗涤。使用BDFACSCantoⅡ细胞仪对PBMC进行分析，荧光值用平均荧光强度（meanfluorescenceintensity，MFI）表示。

4.胞内细胞因子染色：将上述所得PBMC（5×105个）与10μl/mlBrefeldinA在37℃培养箱中共同培养4h。如上所述，将细胞用含1%FBS的PBS洗涤2次，然后用抗CD14和CD16染色。用固定剂A固定细胞15min后用含1%FBS的PBS洗涤。随后用破膜剂B渗透，同时用抗TNF-α-PE避光染色30min。洗涤染色细胞并用BDFACSCantoⅡ细胞仪进行分析，荧光值用MFI表示。

5.胞内细胞因子染色：采用十二项细胞因子检测试剂盒检测血清中TNF-α的含量。将血清与捕获微球缓冲液及荧光检测试剂充分混匀后，室温避光孵育2.5h，随后用1mlPBS溶液洗涤。使用BeamCyte流式细胞仪进行检测分析。

6.统计学分析：采用SPSS21.0软件进行统计分析，对所有定量资料进行正态性和方差检验，正态分布的用表示，非正态分布的用M（Q1，Q3）表示，3组间独立样本使用Kruskal-Wallis

H检验，对有统计学差异的指标进行两两比较分析；2组间独立样本采用Mann-Whitney

U检验；配对比较采用Wilcoxon配对符号秩检验；采用Spearman相关系数检验分析外周血IM比例与CRP、类风湿因子、血沉的相关性；采用Logistic回归分析IM比例、CRP、类风湿因子与RA发病的相关性；定性资料采用χ²检验；采用受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲线）分析IM比例诊断RA的效能。以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、RA和对照组一般临床资料62例RA患者、52例HC和12例疾病对照的一般临床资料见方法学和表1。3组间性别差异有统计学意义（χ2=12.760，P=0.002），年龄差异无统计学意义（H=30134，P=0.209）。

3组单核细胞绝对值和比例差异均有统计学意义，RA组单核细胞绝对值和比例高于HC组，且差异有统计学意义（P<0.001，P<0.001）。二、RA单核细胞亚型分布流式细胞术圈门见图1。通过流式细胞术检测分析62例RA、52例HC及12例疾病对照组外周血单核细胞亚型分布差异。与HC组和疾病对照组相比，RA组CM比例下降，IM比例增加，且差异有统计学意义（表2）。与HC组相比，RA组的NCM比例变化差异无统计学意义，疾病对照组的NCM比例升高。图1

单核细胞亚型流式圈门

三、RA单核细胞亚型TNF-α分泌水平差异胞内细胞因子染色结果显示（表3，图2），和HC组及疾病对照组相比，RA患者单核细胞总体胞内TNF-α水平没有显著变化，但是IM和NCM分泌TNF-α的能力增强，CM分泌TNF-α的差异无统计学意义。在RA组和对照组中，IM自发分泌TNF-α的能力最强，其次是NCM，而CM自发分泌TNF-α的能力最弱，差异均有统计学意义（P均小于0.05）。RA患者IM胞内TNF-α水平和血清TNF-α水平呈正相关，差异有统计学意义（图3）。

图2

3种单核细胞亚型胞内TNF-α阳性率（图2A为CM胞内TNF-α阳性率，图2B为IM胞内TNF-α阳性率，图2C为NCM胞内TNF-α阳性率）

图3

RA患者IM胞内TNF-α水平和血清TNF-α水平的相关性四、HLA-DR差异表达于RA单核细胞亚型流式细胞术结果显示，与HC组及疾病对照组相比，RA组单核细胞总体的HLA-DR表达没有显著变化，但是相较于HC组，RA组和疾病对照组的IM亚群表达更高水平的HLA-DR，且差异有统计学意义（表4）。相较于CM和NCM，IM表达高水平的HLA-DR，且HLA-DR的表达趋势在RA组和对照组中相同，为IM最高，CM次之，NCM最低，差异有统计学意义。五、RA患者外周血IM亚群比例与临床指标的相关性RA患者外周血IM比例和血清CRP（r=0.119，P=0.359）和RF（r=0.204，P=0.112）无明显相关性，与外周血ESR也无明显相关性（r=0.153，P=0.236），见图4。Logistic回归分析IM比例、CRP、RF与RA发病的相关性，结果显示3个指标与RA发病均呈正相关（表5）。ROC曲线分析显示曲线下面积（areaundercurve，AUC）为0.687，95%CI

0.590~0.784，P<0.001（图5）。图4

RA患者外周血IM比例与血液指标的相关性

图5

IM比例诊断RA的受试者工作特征曲线六、不同分期RA患者外周血IM亚群比例与指标差异RA静止期患者的所有指标都低于活动期患者，但只有ESR、CRP、RF的差异有统计学意义（P=0.010，P<0.001，P=0.042）（表6）。讨论单核细胞是机体防御系统的重要组成部分，在清除受伤、衰老的细胞及其碎片的同时，也能识别、杀伤入侵的病原体、肿瘤细胞等，并将抗原提呈给淋巴细胞诱导抗原特异性抗感染、抗肿瘤等免疫反应，同时活化的单核细胞分泌IL-1、TNF-α等多种细胞因子参与免疫反应［6］。因此，单核细胞的异常功能不仅会影响宿主防御，还会影响炎症性疾病的发展［7］。根据单核细胞表面分子的表达及其功能，可将其分为3种亚型，CM占单核细胞的80%~90%，是体内主要的单核细胞亚型，半衰期为1~2d，能识别和吞噬病原体并释放细胞因子。部分CM分化为IM，IM在外周血的比例通常为5%~10%，能释放大量活性氧和细胞因子，半衰期为4~7d。部分IM进一步分化为NCM，NCM作为巡逻单核细胞，在炎症早期释放细胞因子以募集其他免疫细胞［8,

9］。Tsukamoto等［5］研究发现RA患者外周血IM比例增加，且其与疾病活动性呈正相关。本研究显示RA外周血中性粒细胞/单核细胞绝对值和占白细胞比例都增加。中性粒细胞可形成中性粒细胞外捕网释放胞内染色质及蛋白酶类物质，促进RA和SLE等自身免疫性疾病的发生发展［10,

11］，本课题前期研究已发现RA外周血中性粒细胞更易自发形成中性粒细胞外捕网，并做了相关研究。本研究进一步分析单核细胞亚型分布情况，发现与HC组相比，RA组CM比例降低，IM比例增加，而NCM比例没有显著变化，疾病对照组NCM比例增加，说明RA体内总体的IM数量增多。提示在RA发病过程中，更多的CM分化为IM，而IM没有进一步分化为NCM，IM作为主要的促炎症性单核细胞亚型，参与RA的炎症进展。研究显示，系统性红斑狼疮和干燥综合征患者中NCM比例增高［8］，这与本研究结果一致，NCM和免疫复合物结合后可促进B细胞活化和树突状细胞分化，可能在激活系统性红斑狼疮、干燥综合征等免疫复合物相关的自身免疫性疾病的适应性免疫应答中起着重要的作用。

TNF-α是RA发病的重要致病因子之一。已有研究显示RA血清中异常增加TNF-α可刺激滑膜成纤维样细胞分泌多种炎症细胞因子和基质金属蛋白酶，造成关节滑膜炎症浸润和软骨损伤［1，12］。Carracedo等［13］发现，在自发情况下，NCM胞内分泌的TNF-α水平高于CM，本研究进一步发现3种单核细胞亚群胞内TNF-α表达量不同，表现为IM亚群表达量最高，NCM亚群次之，CM亚群最低。RA组与HC组及疾病对照组亚群分析发现，RA组的IM和NCM亚群TNF-α表达量高于HC组和疾病对照组。相关性分析发现RA患者IM胞内TNF-α水平和血清TNF-α水平呈正相关。TNF-α可由单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞分泌［14］，有研究发现，CD14+CD16+单核细胞是人外周血TNF-α的主要来源［15］，这与本研究结果部分相符，RA患者外周血IM比例的增加结合IM和NCM分泌TNF-α增多，是RA患者体内TNF-α含量增多的重要原因之一，IM和RA体内多种免疫细胞的共同作用促进了RA患者血清TNF-α水平的升高。

单核细胞的抗原提呈能力在免疫应答中起着重要的作用。有研究表明，在单核细胞亚型中，IM亚群高表达HLA-DR和CD74等代表抗原提呈能力的分子，其与T细胞受体结合后可促进CD4+细胞活化分泌炎症细胞因子IL-17参与RA的发生发展［16,

17］。急性肝损伤患者体内IM亚群HLA-DR表达下降，HLA-DR表达的减少与促炎功能的下降相关［18］。本研究发现，RA组和HC组及疾病对照组单核细胞总体HLA-DR的表达没有差异，3组单核细胞亚群间HLA-DR表达趋势均为IM最高，CM次之，NCM最低。进一步分析发现，和HC组相比，RA组和疾病对照组IM亚群HLA-DR表达增高，提示IM可能是RA等自身免疫性疾病外周血抗原提呈的关键细胞，IM比例的增加及IM上HLA-DR表达升高可能与RA体内适应性免疫增强相关且可能促进RA体内的炎症反应。通过抑制CM向IM及NCM的分化能否缓解RA患者体内的适应性免疫应答及TNF-α等炎症因子的分泌的研究目前尚未见报道。由于流式仪荧光通道限制，本研究仅分析了在RA致病中最重要的细胞因子之一TNF-α和代表抗原提呈能力的分子之一