双水相萃取详细资料

方盼赵梅双水相萃取（一）两水相的形成（二）相图（三）分配理论（四）影响分配的参数（五）应用目录常用的溶液萃取法能用来提取生物大分子如蛋白质吗？QuestionReasonso大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。通常的溶剂萃取法应用于提取生物大分子是有困难的；但双水相萃取法含水量高，接近生理的环境中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性双水相体系简介1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂和可溶性淀粉的水溶液混合时先得到一个混不透明的溶液，随之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉），这种现象被称之为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系。双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统葡聚糖（Dextran）与聚乙二醇（PEG）按一定比例与水混合，溶液混浊，静置平衡后，分成互不相溶的两相，上相富含PEG、下相富含葡聚糖，见下图（一）两水相的形成两种亲水性聚合物混合1混合熵的增加—自发进行—分子的数目2分子间作用力—分子间各基团相互作用之和——分子的大小对大分子而言，由于相对分子质量较大，分子间作用力与熵增加相比占主导地位。原理作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分别富集于上、下两相。作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均相的高聚物水溶液聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相中。高聚物与与高聚物物形成两两相是由由于高聚聚物的不不相容性性高聚物与与无机盐盐溶液也也能形成成两相，，这是由由于盐析析作用。。生化工程程中，多多应用聚聚乙二醇醇—-葡葡聚糖和和聚乙二二醇-无无机盐系系统。双水相系系统PEG=聚聚已二醇醇Kpi=磷磷酸钾DX=葡聚聚糖双水相萃萃取:利用生物物大分子子在两种种水相之之间的分分配比例例不同而而达到分分离纯化化生物大大分子的的目的。（二）相相图两种高聚聚物的水水溶液，，当它们们以不同同的比例例混合时时，可形形成均相相或两相相，这种种水性两两相的形形成条件件和定量量关系，，常用相相图来表表示，它它是一条条双节线。只有当P和Q达达到一定定浓度才才能形成成两相双节线系线（具体的的证明过过程省略略）系线的长度度是衡量两两相间差别别的尺度，，系线越长长两相间的的差别越大大，反之越越小。当系线向下下移动时，，长度逐渐渐减小，这这说明两相相的差别减减小，当达达到K点时时，系线的的长度为0，两相间间差别消失失，点s成成为临界点点。（三）分配配理论和溶剂萃取取法一样，，蛋白质在在两水相间间的分配，，有分配系系数K=C1/C2C1代表上上相浓度，，C2代表表下相浓度度。当相系系统固定时时，分配系系数为一常常数只取决决于被分离离物质本身身的性质和和特定的双双水相体系系，与蛋白白质的浓度度无关。当物质进入入双水体系系后，由于于表面性质质/电荷作作用和各种种力（如憎憎水键/氢氢键和离子子键）的存存在和环境境的影响，，物质在上上相和下相相间进行选选择性分配配，（四）影响响物质分配配平衡的因因素主要有聚合合物的分子子量和浓度度/pH/演的种类类和浓度/温度等。。适当的选选择各参数数即在最适适条件下，，可达到较较高的分配配系数和选选择性当聚合物相相对分子质质量降低时时，蛋白质质易分配于于富含该聚聚合物的相相中。例如：PEG/DX系统中中当PEG的分子量量降低时，，会使蛋白白质易分配配于富含该该PEG的的相中，使使分配系数数增大，而而葡聚糖的的分子量减减小，会使使分配系数数降低，这这是一条普普遍规律成相聚合合物的相相对分子子质量这是因为为成相聚聚合物的的疏水性性对酶等等亲水性性物质的的分配产产生较大大的影响响。同一聚合合物的疏疏水性随随分子量量的增大大而增大大，当PEG的的分子量量增加是是，在质质量浓度度不变的的情况下下，其两两端羟基基数减少少，疏水水性增加加，亲水水性的蛋蛋白质不不再向富富含PEG相中中聚集，，而转向向另一相相。那么么，，分分子子量量降降低低时时，，蛋蛋白白质质就就易易分分配配于于富富含含PEG的的相相了了当接接近近临临界界点点时时，，上相相和和下下相相的的组组成成相相同同蛋白白质质均均匀匀的的分分配配于于两两相相中中，，分分配配系系数数接接近近于于1。。当成成相相系系统统的的总总浓浓度度增增大大时时，，系系统统远远离离临临界界点点，，系系线线长长度度增增加加，，两两相相性性质质的的差差别别增增大大，，蛋蛋白白质质分分子子的的分分配配系系数数（（分配配系系数数为为一一常常数数只只取取决决于于被被分分离离物物质质本本身身的的性性质质和和特特定定的的双双水水相相体体系系，，与与蛋蛋白白质质的的浓浓度度无无关关。）就就会偏偏离临临界点点的值值（=1）），即即大于于1或或小于于1。。成相聚聚合物物的浓浓度在双水水相聚聚合物物系统统中，，加入入电解解质，，首先先阴阳阳离子子会有有不同同的分分配。。盐的正正负离离子在在两相相间的的分配配系数数不同同，由由于各各相应应保持持电中中性，，因而而在两两相中中形成成电位位差，，这对对带电生生物大大分子子的分配配，产产生很很大的的影响响。盐类的的影响响K-＞＞1分分配配在上上相K+≈≈1分分配配在下下相在pH6.9时时溶菌菌酶带带正电电，卵卵蛋白白带负负电。。当加加入NaCl时时，其其浓度度低于于50mmol/L时可可见上上相电电位低低于下下相电电位，，使溶溶菌酶酶分配配在上上相，，从而而分配配系数数增大大。而而卵卵蛋白白的分分配系系数减减小，，。结论：：加入入适当当的盐盐类，，会大大大促促进带带相反反电荷荷的生生物大大分子子的分分离。。pH值值对分分配的的影响响源于于两个个方面面的原原因：：（一））pH值会会影响响蛋白白质中中可以以解离离基团团的解解离度度，因因而改改变蛋蛋白质质所带带的电电荷和和分配配系数数。pH（二））pH值会会影响响磷酸酸盐的的解离离程度度，改改变H2PO4-和和HPO42-之间间的比比例，，而影影响分分配系系数。。pH的的微小小变化化会使使蛋白白质的的分配配系数数改变变2～～3个个数量量级。。温度影影响相相图，，特别别在临临界点点附近近，因因而也也影响响分配配系数数，温度越越高发发生相相分离离所需需的高高聚物物浓度度越高高温度应用工业方方面小分子子分离离和纯纯化技术的的新发发展双水相相萃取取系统统的优优点直接从从cell碎片片匀浆浆中萃萃取prot、、而无无需将将细胞胞碎片片分离离双水相系统平平衡时时间短短，含含水量量高，，界面面张力力低，，成相相聚合合物对对蛋白白质有有稳定定作用用，为为生物物活性性物质质提供供了温温和的的分离离环境境操作简简便，，经济济省时时，易易于放放大.由于于很容容易达达到平平衡，，用商商业上上的离离心机机能使使相分分离完完全，，分配配系数数的值值重演演性很很好，，故可可直接接放大大改变体体系的的pH和电电解质质浓度度可进进行反反萃取取工艺方方面应用范范围：胞内酶酶的提提取（（双水水相系系统可可用于于除去去细胞胞破碎碎后的的匀浆浆液中中的碎碎片以以及酶酶的进进一步步精制制）运用双双水相相法萃萃取需需满足足的条条件：1.欲欲提取取的酶酶与细细胞分分配在在不同同的相相中；；2.酶酶的分分配系系数足足够大大，使使在一一定的的相体体积比比时，，经过过一次次萃取取就能能得到到较高高的收收率；；3.两两相用用离心心机很很易分分离。。通常将将蛋白白质分分配在在上相相，而而细胞胞碎片片分配配在下下相（（盐））合理调调整双双水相相组成成，从从实用用角度度看，，碎片片分配配在下下相的的好处处多Y=××100%☆目标蛋蛋白质在在上相的的收率（（Y）为为：实际上最困难的的是如何在保保证碎片片分配在在下相的的同时，，把蛋白白质产物物尽可能能完全地地分配在在上相。。实验证明明，在大大多数场场合下，，收率Y都能达达到90%；分分配系数数在2~20之间间，多数数场合大大于3；；很多杂杂蛋白也也能同时时除去。。单位质量量相系统统中匀浆浆液的加加入量：：经济上上考虑希希望越多多越好，，但若匀匀浆液太太多会影影响原来来成相聚聚合物的的相系统统，改变变相比或或者使分分配系数数降低。。根据Kula的的经验，，一般取取一千克克萃取系系统处理理200到400克湿湿菌体为为宜。PEG系系统中细细胞碎片片分配到到下相中中较容易易分配在上上相中的的蛋白质质可通过过加入适适量的盐盐（有时时也可加加入适量量的PEG），，尽兴第第二次双双水相萃萃取，以以除去多多糖和核核酸，它它们的亲亲水相较较强因而而容易分分配在盐盐相中，，而蛋白白质就留留在了PEG相相中；在在第三步步萃取中中，应该该使蛋白白质分配配在盐相相中（例例如：调调节pH），以以使和主主体PEG分离离。色素素由于其其疏水性性，通常常分配在在上相。。主体PEG可可循环使使用，而而盐相蛋蛋白质则则可用超超滤方法法去除残残余的PEG以以提高产产品的纯纯度。三步两水水相萃取取酶的流流程：细胞匀浆浆液第一步双双水相萃萃取+PEG+盐盐（或是是葡聚糖糖）分离机下相上相（（PEG相）细胞碎片片（目标产产物）如如prot、E杂蛋白+盐（核酸、、多糖））第二步双双水相萃萃取下相（（盐相））上相（（PEG相）核酸多糖糖目目标产产物静置分层层杂蛋白+盐盐（亲水性性较强））第三步双双水相萃萃取静置分层层下相（（盐相））上相（目标产产物）（PEG、杂蛋蛋白、色色素）UF（（PEG可循环环使用））提纯产品品多步萃取取的目的的是为了了获得较较高的纯纯化倍数数。小分子分分离和纯纯化1990年科研研人员发发现在PEG/磷酸盐盐系统中中，某些些氨基酸酸和青霉霉素的分分配是不不均匀的的，例如如：赖氨氨酸的分分配系数数为0.23，，而类黑黑素的分分配系数数为7.1，从从而可将将二者分分离。引引起人们们利用双双水相分分配分离离纯化小小分子的的兴趣，，特别应应用于从从一些粘粘度大、、难过率率、易乳乳化的发发酵液中中提取。。分离纯化化小分子子同样的的也利用用的是PEG/盐系统统双水相萃萃取技术术的进展展廉价双水水相体系系的开发发：两种双水水相体系系的比较较体系优点缺点高聚物/高聚物盐浓度低，活性损失小，可用离子交换层析纯化成本高，粘度大，分相困难高聚物/盐成本低，粘度小，比较适合工业规模的应用盐浓度高，非盐水的处理比较困难，活性损失大,界面吸附多双水相萃萃取技术术同其他他分离技技术相结结合A、双水相体体系同生生物转化化相结合合：B、双水相萃萃取同膜膜分离技技术相结结合：C、双水相萃萃取同亲亲和层析析相结合合——亲亲和萃取取（亲和和分配））：亲和分配配蛋白质在在两水相相系统中中的分配配系数一一般不是是很大，，为了提提高分配配系数和和萃取效效率，可可将亲和和层析与与两水相相萃取结结合起来来，成为为亲和萃萃取或亲亲和分配配，即把把一种配配基与一一种成相相聚合物物以共价价相结合合，使该该配基随随成相聚聚合物分分配在某某一相中中。配基基可也是是酶的底底物，抑抑制剂，，抗体，，受体或或染料等等，对目目标蛋白白质有很很强的生生物亲和和力，因因而使后后者倾向向于分配配在配基基—聚合合物的相相中。通常选择择在PEG上接接上配基基，当配配基—PEG的的浓度增增加时，，蛋白质质的分配配系数也也增加。。当蛋白白质的结结合位点点都为配配基所占占据时，，即达到到饱和，，蛋白质质的