凝胶柱层析的操作与应用课件

第七章层析分离技术第七章层析分离技术1第一节层析的基本原理与分类一、层析分离的基本原理与特点（一）基本原理层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。第一节层析的基本原理与分类一、层析分离的基本原理与特点2（二）层析分离具有如下基本特点优点：（l）分离效率高。（2）应用范围广。（3）选择性强。（4）设备简单，操作方便。缺点：处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室，工业生产上还应用较少。（二）层析分离具有如下基本特点3

（三）层析的基本概念

1.固定相2.流动相3.分配系数及迁移率（或比移值）4.分辨率（或分离度）5.正相色谱与反相色谱6.操作容量（或交换容量）

（三）层析的基本概念

1.固定相4二、层析分离技术的分类（一）依操作形式分分为纸层析、薄层层析和柱层析。二、层析分离技术的分类（一）依操作形式分5（二）依流动相分根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。（二）依流动相分6（三）依分离机理分1.吸附层析2.分配层析3.凝胶过滤4.离子交换层析5.亲和层析6.疏水层析（三）依分离机理分7

第二节层析分离的基本操作技术

一、柱层析基本操作技术（一）柱层析的基本装置1、固定相2、流动相3、收集系统4、检测系统5、蠕动泵

第二节层析分离的基本操作技术

一、柱层析基本操作技术8（二）柱层析系统的基本操作技术

1.装柱

2.平衡

3.加样

4.洗脱

5.流速控制

6.分部收集

7.洗脱峰检测、合并收集

8.层析介质的再生

（二）柱层析系统的基本操作技术

1.装柱

2.平衡

3.加样9二、纸层析基本操作技术

（一）滤纸（二）展开剂（三）操作方法（四）在抗生素中的应用二、纸层析基本操作技术（一）滤纸10三、薄层层析基本操作技术

（一）基本原理（二）吸附剂和展开剂的选择（三）基本操作1.薄层板的制备2.样品的预处理3.点样、展层与显色4.影响Rf的主要因素5.薄层色谱法的应用三、薄层层析基本操作技术（一）基本原理11第三节

吸附柱层一、吸附层析的原理与特点基本原理同吸附薄层色谱法。

二、吸附剂的选择

常用的吸附剂除氧化铝、硅胶和聚酞胺外，还有活性炭。吸附剂的种类很多，而对吸附剂的选择尚无固定的法则，一般需通过小样实验来确定。第三节吸附柱层一、吸附层析的原理与特点12

三、吸附柱层析的基本操作与应用

装柱（1）干法装柱在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层干净的砂粒，打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致，最后，将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至刚好覆盖吸附剂顶部平面，关紧下口活塞。（2）湿法装柱将吸附剂加入合适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊状，先把放好棉花、砂子的色谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌人柱子。注意，整个操作要慢，不要将气泡压人吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂，切勿流干，最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。

三、吸附柱层析的基本操作与应用

装柱（1）干法装柱13

三、吸附柱层析的基本操作与应用

上样（1）湿法上样把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞口。（2）干法上样多数情况下，被分离物质难溶于最初使用的洗脱剂，这时可选用一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。

三、吸附柱层析的基本操作与应用

上样（1）湿法上样14

三、吸附柱层析的基本操作与应用

洗脱在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度洗脱，各组分先后被洗出。若用50g吸附剂，一般每份洗脱液量常为50rnLo但若所用洗脱剂极性较大或各成分的结构很近似时，每份的收集量要小。

整个操作过程必须注意不使吸附柱表面的溶液流干，即吸附柱上端要保持一层溶剂。此外，应控制洗脱液的流速，流速不应太快。着流速过快，柱中交换来不及达到平衡，因而影响分离效果。

三、吸附柱层析的基本操作与应用

洗脱在装好吸附剂的色谱15第四节离子交换柱层析一、原理与特点电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。

第四节离子交换柱层析一、原理与特点电荷基团与高分子聚合物共16

（一）离子交换剂的基质

（二）离子交换剂的电荷基团

根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。

（三）交换容量

交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。二、离子交换层析剂的种类

（一）离子交换剂的基质

（二）离子交换剂的电荷基团

根据与17（四）离子交换剂的选择、处理和保存

1、离子交换剂的选择

取决于被分离的物质在其稳定的pH值下所带的电荷，离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。2、离子交换剂的处理和保存

处理：干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，再用酸碱分别浸泡3、离子交换树脂的选择依据（四）离子交换剂的选择、处理和保存18三、离子交换柱层析的操作与应用（一）离子交换柱层析的操作1．层析柱2．平衡缓冲液3．上样4．洗脱缓冲液5．洗脱速度6．样品的浓缩、脱盐（二）离子交换柱层析的应用1.水处理2.分离纯化小分子物质3.分离纯化生物大分子物质三、离子交换柱层析的操作与应用19第五节凝胶柱层析一、凝胶层析的原理凝胶层析又称分子排阻层析、分子筛层析或凝胶过滤。它是指混合物随流动相经固定相（凝胶）的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。

固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质。又因整个层析过程一般不变换洗脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤。第五节凝胶柱层析一、凝胶层析的原理凝胶层析又称分子排20二、凝胶的种类1.葡聚糖凝胶2.琼脂糖凝胶3.聚丙烯酰胺凝胶二、凝胶的种类21三、凝胶柱层析的操作与应用（一）凝胶柱层析的操作特点1、凝胶柱层析优点：（1）分离条件温和，因此不易引起生物样品的变性失活；（2）每次分离操作之后，层析剂无需再生就可重复利用；（3）工作范围广，分离的分子质量范围可从几百到数百万；（4）设备简单，分离机理简单，易于操作；（5）样品回收率高，几乎可达100%。2、凝胶层析的缺点：凝胶层析上样量小，操作压力不能高，流速较慢。三、凝胶柱层析的操作与应用22（1）主要用于脱盐

（2）类分离

（3）分级分离

（4）生物大分子分子量的测定

（二）凝胶柱层析的特点与应用（1）主要用于脱盐

（2）类分离

（3）分级分离

（4）生物23第六节疏水柱层析一、疏水层析的原理亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团。尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。第六节疏水柱层析一、疏水层析的原理24

二、疏水性吸附剂

各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基（C3-C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。

二、疏水性吸附剂

各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用25

三、疏水柱层析的操作与应用

（一）疏水柱层析的操作特点1、层析柱的制备2、平衡3、加样与洗脱4、再生

三、疏水柱层析的操作与应用

（一）疏水柱层析的操作特点26（二）疏水柱层析的特点与应用1、疏水柱层析特点：（1）疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液；（2）分辨率很高、流速快、加样量大；（3）疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。2、疏水柱层析应用：疏水柱层析适用于分离的任何阶段，尤其是样品离子强度高时，即在盐析、离子交换或亲和层析之后用。疏水柱层析主要用于蛋白质类生物大分子分离纯化。（二）疏水柱层析的特点与应用1、疏水柱层析特点：（1）疏水柱27第七节亲和柱层析一、亲和柱层析的原理（一）配基固定化：选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的分离介质；（二）吸附样品：亲和吸附介质选择性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除；（三）样品解析：选择适宜的条件，使被吸附的亲和介质上的酶或其他生物活性物质解吸第七节亲和柱层析一、亲和柱层析的原理28

二、亲和吸附介质

用于亲和层析的理想载体常选用均一的珠状颗粒，特别是琼脂糖和交联葡聚糖，但也使用合成的聚丙烯酰胺凝胶、纤维素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。选作配基的分子必须具有适当的化学基团，该基团不参与配基与生物分子的特异结合，但是却可以用来连接配基与载体。将亲和配基共价偶联在载体的表面，即可制得亲和吸附介质。一般凝胶过滤介质均可作为亲和配基的载体来制备亲和吸附介质。

二、亲和吸附介质

用于亲和层析的理想载体常选用均一的珠状颗29三、亲和柱层析的操作与应用（一）亲和柱层析的操作特点1．基本过程（1）进料吸附（2）杂质清洗（3）目标产物洗脱（4）层析柱再生三、亲和柱层析的操作与应用30

（二）亲和层析的特点与应用

1、亲和层析的特点：在生物制品分离和分析领域有宽广的应用开发前景。由于其具有简便、快速、专一和高效等特点，亲和层析的应用十分广泛，已普及到生命科学的各个领域。2、亲和层析亲和层析的应用：（1）分离和纯化各种生物分子（2）分离纯化各种功能细胞（3）用于各种生化成分的分析检测

（二）亲和层析的特点与应用

1、亲和层析的特点：在生物制品31第八节分配柱层析一、分配柱层析的基本原理分配柱层析是利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同而使混合物得到分离。固定在柱内的液体叫固定相，用作冲洗的液体叫流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体来吸牢它，这种固体本身不起什么分离作用，也没有吸附能力，只是用来使固定相停留在柱内，这种固体叫载体。进行分离时先将含有固定相的载体装在柱内，加少量被分离的溶液后，用适当溶剂进行洗脱。在洗脱过程中，流动相与固定相发生接触，由于样品中各成分在两相之间的分布不同，因此向下移动的速度不同，容易溶于流动相中的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动就慢，因此得到分离。第八节分配柱层析一、分配柱层析的基本原理32二、分配柱层析的载体（一）硅胶吸水量为50%时仍为粉末状，当其吸水量在17%以上时，硅胶就失去其吸附作用，作为载体使用，此时硅胶层析则为分配层析。

（二）硅藻土具有微孔结构，不具吸附作用，是现在使用最多的载体。其处理和装柱方法基本同硅胶相似。（三）纤维素二、分配柱层析的载体33三、分配柱层析的固定相与展开剂（一）固定相

常用的固定相有水、各种缓冲溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及为水所饱和的有机溶剂等。有时也采用“反相层析法”，即用有机溶剂为固定相，而以水或水溶液或与水混合的有机溶剂为流动相。

（二）展开剂流动相一般用为水所饱和的有机溶剂或水一有机溶剂互溶的混合液，一般常用的流动相溶剂有石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷类、苯类等，或它们的混合物。反相层析法常用的流动相，则为正相层析法中的固定相，如水、各种水溶液（包括酸、碱、盐与缓冲液）、低级醇类等。

三、分配柱层析的固定相与展开剂（一）固定相34三、分配柱层析的基本操作（一）装柱

装柱前，将固定相与载体混合，如果用硅胶、纤维素等载体时，可以直加固定相直接混合，用硅藻土为载体先把硅藻土放在大量流动相液体中，在不断搅拌下，逐渐加入固定相。

（二）加样1、将被分离物配成浓溶液，用吸管轻轻沿管壁加到含固定相载体的上端，然后加流动相洗脱；2、被分离物溶液用少量含固定相的载体吸收，溶剂挥发后，加在层析管载体的上端，然后加流动相洗脱；3、用一块比管径略小的圆形滤纸吸附被分离物溶液，溶剂挥发后，放在载体上，然后加流动相洗脱。三、分配柱层析的基本操作（一）装柱35

四、分配柱层析的特点与应用

（一）特点：分配柱层析具有载体来源容易、分离成本低、流速快等特点,适用于分离极性比较大、在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。（二）应用：分配柱层析多用于分离亲水性的成分，如苷类、糖及氨基酸类。

四、分配柱层析的特点与应用

（一）特点：36第九节气相色谱一、气相色谱仪的结构及其工作过程（一）气相色谱仪的结构1.气路系统2.进样系统3.色谱柱4.检测器系统5.温控系统6.数据处理系统第九节气相色谱37（二）工作过程分离分析前，选择适当的色谱柱和流动相，设置好分离操作参数，打开高压钢瓶供给载气，载气经减压阀减压后，进入载气净化器以除去载气中的水分等杂质，由稳压阀和稳流阀控制载气的压力和流量，再流经进样器；试样从进样器注入，由载气携带进入色谱柱，试样中各组分按分配系数的大小顺序，依次被载气带出色谱柱，进入检测器，检测器将物质的浓度或质量变化转变为电信号，由记录仪记录，得到色谱图，并以此进行定性、定量分析。（二）工作过程分离分析前，选择适当的色谱柱和流动相，设置好分38二、气相色谱法的特点

选择性高灵敏度高分离效能高分析速度快应用范围广等特点二、气相色谱法的特点

选择性高39三、气相色谱分离条件的选择（一）固定相的选择（二）载气流速的选择（三）柱温的选择（四）进样量与进样时间的影响（五）色谱柱形、柱内径及柱长的选择三、气相色谱分离条件的选择40四、气相色谱分析方法（一）定性分析方法1.比较相对保留值2.用已知标准物增加峰高法（二）定量分析方法1．校正因子的测定2．定量方法四、气相色谱分析方法41五、气相色谱的应用

（一）应用生物科学（二）可以检测农副产品、食品、水质中残留的农药。（三）对食品中的乙醇等组分、山梨酸和苯甲酸等添加剂以及食品中的污染物进行分离分析。（四）对大气中污染成分和水质中的可溶性气体、农药、多卤联苯、酚类、有机胺等污染物进行分离分析。五、气相色谱的应用

（一）应用生物科学42第十节高效液相色谱一、高效液相色谱仪的组成及工作原理

（一）高效液相色谱仪的组成1.高压输液系统：贮液罐及流动相；高压输液泵；过滤器；梯度洗脱装置2.进样系统：包括取样、进样两个功能，有进样器进样、阀进样、自动进样器三种方法3.分离系统：包括色谱柱及柱温箱，色谱柱常用内壁抛光的不锈钢管，主要由柱管、固定相填料和密封垫组成。4.检测系统：常用紫外（UV）、二级管阵列（PDA）、荧光（FD）、示差（DRD）、蒸发光（ELSD）。5.色谱工作站：第十节高效液相色谱一、高效液相色谱仪43（二）工作原理分析或分离前，选择适当的色谱柱和流动相，设置好分离操作参数，待贮液瓶中的溶剂经脱气、过滤后，打开高压泵，冲洗色谱柱，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器（进样器）把样品注入进样口，流经进样器的流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分从色谱柱流出后依次流入检测器的流通池，检测器把组分浓度转变成电信号，产生的电信号经过放大，被记录仪记录或经数据处理系统（色谱工作站）进行数据处理，得到色谱图。其色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。（二）工作原理分析或分离前，选择适当的色谱柱和流动相，设置好44二、HPLC的特点（一）高压（二）高速（三）高灵敏度（四）高效（五）适用范围广二、HPLC的特点45三、分析型HPLC的操作特点（一）采用小直径柱（二）低流速、低压力（三）高灵敏度（四）以分析为目的三、分析型HPLC的操作特点46

四、制备型HPLC的操作特点

（一）大直径柱（二）高流速、高压力（三）低灵敏度（四）以制备大量（大于0.1g）为目的

四、制备型47五、HPLC工作过程

取样选择方法：一般作反相；选分离模式选择柱子：选固定相粒度；选柱内径及柱效选择分离条件：调保留值、容量因子；调相邻组分分离度；控制相邻组分选择系数；调流动相流量提高柱效特殊考虑：柱温；梯度洗脱五、HPLC工作过程取样48

实验十胡萝卜素的柱层析分离

实验十胡萝卜素的柱层析分离49一、实验准备

（一）实验原理及目的1、原理本实验采用氧化铝为固定相的吸附层析。各种物质具有不同的吸附力，胡萝卜素存在于胡萝卜、辣椒等黄绿色植物中，由于在动物体内可将胡萝卜素转变为维生素A，故又称维生素A原。胡萝卜素（属多烯色素类，又可分为α、β、γ等几种类型）可用乙醇、石油醚和丙酮等有机溶剂从食物中提取出来，并能被氧化铝所吸附。由于胡萝卜素与其他植物色素的化学结构不同，它们在有机溶剂中的溶解度以及被氧化铝吸附的强度也不相同，故将抽提液进行氧化铝柱层析，再用石油醚等冲洗层析柱，即可将植物提取液中混合的胡萝卜素分离成不同的色带。同植物其他色素相比较，胡萝卜素的极性最小，吸附最差，用石油醚洗脱速度最快，故被最先洗脱下来，使胡萝卜素与其他色素分开。同时也可将胡萝卜素层析带洗脱下来进行比色定量。一、实验准备（一）实验原理及目的50

2、目的（1）了解柱层析的基本原理（2）掌握胡萝卜素分离的操作方法（二）试剂及器具1、材料新鲜红辣椒、氧化铝（Al2O3，高温烘烤除去水分，提高其吸附力）2、试剂95%乙醇、无水硫酸钠、石油醚（沸点60～90℃）、1%丙酮-石油醚液（丙酮：石油醚=1：1；体积比）、三氯化锑氯仿溶液（称取三氯化锑22g，加100ml氯仿溶解后，贮于棕色瓶中）。3、器具剪刀、研钵，层析柱（1cm×16cm）,100ml分液漏斗，量筒100ml，铁架台及蝶形夹，蒸发皿，恒温水浴，天平，烧杯、软木塞、棉花、胶头滴管、滤纸、试管2、目的51二、实验过程

乙醇石油醚蒸馏水硫酸钠红辣椒研磨研磨洗涤提取液除水上样层析收集洗脱液鉴别二、实验过程乙醇石52三、注意事项

（一）实验中一定要将新鲜红辣椒研细，以彻底破坏植物细胞，使胡萝卜素释放更完全。丙酮可增强分离效果，有利于对胡萝卜素的提取，若分离条件控制得好，可依次提取、分离得到α胡萝卜素，ß胡萝卜素、γ胡萝卜素，以及紧随其后的是辣椒红素，番茄红素及叶黄素等植物色素。（二）为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂缝和气泡，氧化铝的高度一般为玻璃柱高度的3/4，装好柱后柱上面覆一层滤纸，以保持柱上端顶部平整，若上端不平，影响分离效果而产生不规则的条带。（三）分离洗脱过程中，要连续不断加入洗脱液，并保持一定高度的液面，在整个操作中绝不能使氧化铝表面的液体流干。三、注意事项（一）实验中一定要将新鲜红辣椒研细，以彻底破坏53（四）三氯化锑腐蚀性较强，在实验过程中切勿触及皮肤。三氯化锑遇水生成碱式盐，再转变成氯氧化锑，此化合物与胡萝卜素不发生颜色反应，而出现浑浊。（五）石油醚提取液中的乙醇必须洗净，否则吸附不好，层析中色带也弥散不清。（六）层析柱底部棉花的用量不宜过多，松紧要适宜，否则将影响流速。（四）三氯化锑腐蚀性较强，在实验过程中切勿触及皮肤。三氯化锑54实验十一离子交换色谱分离混合氨基酸实验十一离子交换色谱分离混合氨基酸55一、实验准备

（一）实验原理及目的1、原理本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量为133.1）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=9.74，分子量为146.2）的混合液。在pH=5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH=12条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样，通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。2、目的(1)、了解离子交换树脂分离氨基酸基本原理(2)、掌握阳离子交换树脂处理技一、实验准备56（二）试剂及器具1、材料磺酸型阳离子交换树脂（732型）2、试剂树脂处理液：2mol/LNaOH、2mol/LHCL、1mol/LHCL、1mol/LNaOH、0.45mol/L柠檬酸缓冲液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH缓冲液（pH=12）、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。3、器具离子交换色谱柱、量筒、吸管、收集器、试管、恒流泵。（二）试剂及器具57二、实验过程

树脂处理、转型装柱平衡上样洗脱收集测定

二、实验过程58三、注意事项

（一）为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂缝和气泡。（二）分离洗脱过程中，要连续不断加入洗脱液，并保持一定高度的液面，在整个操作中绝不能使树脂表面的液体流干。（三）一直保持流速10滴/min～12滴/min，并注意勿使树脂表面干燥。三、注意事项（一）为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂59实验十二凝胶柱层析分离蛋白质

实验十二凝胶柱层析分离蛋白质60一、实验准备

（一）实验原理及目的1、原理：凝胶层析（gelchromatography）是利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的技术。当溶液在层析柱内流过时，各种物质分子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直径大，难于进入凝胶颗粒的微孔，只能在凝胶颗粒的间隙中随流动相快速向下移动；而小分子物质能够扩散进入凝胶颗粒的微孔中，因此在流动过程中不断地进出于胶粒的微孔，这样就使小分子物质向下移动的速度落后于大分子物质，从而使溶液中的各组分按分子量从大到小的顺序先后流出层析柱，达到分离纯化的目的。本实验主要学习葡聚糖凝胶柱层析分离（凝胶过滤）的基本操作技术环节，如柱层析填充介质（凝胶）的溶胀、装柱、平衡、洗脱等。一、实验准备（一）实验原理及目的612、目的：（1）熟悉凝胶层析分离的基本原理；（2）掌握凝胶柱层析填充物的装柱、平衡、加样、洗脱等基本操作技术（二）试剂及器具1、材料SephadexG-50（或G-75）、蓝色葡聚糖2000、牛血清蛋白2、试剂磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。缓冲液的配制方法：先称取一定量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，用去离子水分别溶解、配制成3L浓度为0.1mol/L的溶液，然后将这两种溶液边按一定比例混合，边用酸度计检测，调配成pH7.0的磷酸盐缓冲液3、器具酸度计、层析柱（1.6cm×30cm）、铁架台、试管（多个）紫外分光光度计或紫外检测仪、电炉、容量瓶（1L）、烧杯、三角瓶、滴管、移液管、电子天平、玻棒、塑料壶（3~5L）。2、目的：62二、实验过程

凝胶溶胀装柱平衡加样洗脱绘制曲线二、实验过程63三、注意事项

（一）层析柱大小可根据实际需要选择，一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生管壁效应，即柱管中心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。（二）装好的层析柱凝胶要均匀，不能有断层或纹路或气泡，将柱管对着光照方向观察，若层析柱床不均匀，必须重新装柱。（三）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。（四）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变差，不得不重新装柱。（五）洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果。三、注意事项（一）层析柱大小可根据实际需要选择，一般来说，64凝胶柱层析的操作与应用课件65凝胶柱层析的操作与应用课件66凝胶柱层析的操作与应用课件67凝胶柱层析的操作与应用课件68第七章层析分离技术第七章层析分离技术69第一节层析的基本原理与分类一、层析分离的基本原理与特点（一）基本原理层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。第一节层析的基本原理与分类一、层析分离的基本原理与特点70（二）层析分离具有如下基本特点优点：（l）分离效率高。（2）应用范围广。（3）选择性强。（4）设备简单，操作方便。缺点：处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室，工业生产上还应用较少。（二）层析分离具有如下基本特点71

（三）层析的基本概念

1.固定相2.流动相3.分配系数及迁移率（或比移值）4.分辨率（或分离度）5.正相色谱与反相色谱6.操作容量（或交换容量）

（三）层析的基本概念

1.固定相72二、层析分离技术的分类（一）依操作形式分分为纸层析、薄层层析和柱层析。二、层析分离技术的分类（一）依操作形式分73（二）依流动相分根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。（二）依流动相分74（三）依分离机理分1.吸附层析2.分配层析3.凝胶过滤4.离子交换层析5.亲和层析6.疏水层析（三）依分离机理分75

第二节层析分离的基本操作技术

一、柱层析基本操作技术（一）柱层析的基本装置1、固定相2、流动相3、收集系统4、检测系统5、蠕动泵

第二节层析分离的基本操作技术

一、柱层析基本操作技术76（二）柱层析系统的基本操作技术

1.装柱

2.平衡

3.加样

4.洗脱

5.流速控制

6.分部收集

7.洗脱峰检测、合并收集

8.层析介质的再生

（二）柱层析系统的基本操作技术

1.装柱

2.平衡

3.加样77二、纸层析基本操作技术

（一）滤纸（二）展开剂（三）操作方法（四）在抗生素中的应用二、纸层析基本操作技术（一）滤纸78三、薄层层析基本操作技术

（一）基本原理（二）吸附剂和展开剂的选择（三）基本操作1.薄层板的制备2.样品的预处理3.点样、展层与显色4.影响Rf的主要因素5.薄层色谱法的应用三、薄层层析基本操作技术（一）基本原理79第三节

吸附柱层一、吸附层析的原理与特点基本原理同吸附薄层色谱法。

二、吸附剂的选择

常用的吸附剂除氧化铝、硅胶和聚酞胺外，还有活性炭。吸附剂的种类很多，而对吸附剂的选择尚无固定的法则，一般需通过小样实验来确定。第三节吸附柱层一、吸附层析的原理与特点80

三、吸附柱层析的基本操作与应用

装柱（1）干法装柱在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层干净的砂粒，打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致，最后，将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至刚好覆盖吸附剂顶部平面，关紧下口活塞。（2）湿法装柱将吸附剂加入合适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊状，先把放好棉花、砂子的色谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌人柱子。注意，整个操作要慢，不要将气泡压人吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂，切勿流干，最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。

三、吸附柱层析的基本操作与应用

装柱（1）干法装柱81

三、吸附柱层析的基本操作与应用

上样（1）湿法上样把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞口。（2）干法上样多数情况下，被分离物质难溶于最初使用的洗脱剂，这时可选用一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。

三、吸附柱层析的基本操作与应用

上样（1）湿法上样82

三、吸附柱层析的基本操作与应用

洗脱在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度洗脱，各组分先后被洗出。若用50g吸附剂，一般每份洗脱液量常为50rnLo但若所用洗脱剂极性较大或各成分的结构很近似时，每份的收集量要小。

整个操作过程必须注意不使吸附柱表面的溶液流干，即吸附柱上端要保持一层溶剂。此外，应控制洗脱液的流速，流速不应太快。着流速过快，柱中交换来不及达到平衡，因而影响分离效果。

三、吸附柱层析的基本操作与应用

洗脱在装好吸附剂的色谱83第四节离子交换柱层析一、原理与特点电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。

第四节离子交换柱层析一、原理与特点电荷基团与高分子聚合物共84

（一）离子交换剂的基质

（二）离子交换剂的电荷基团

根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。

（三）交换容量

交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。二、离子交换层析剂的种类

（一）离子交换剂的基质

（二）离子交换剂的电荷基团

根据与85（四）离子交换剂的选择、处理和保存

1、离子交换剂的选择

取决于被分离的物质在其稳定的pH值下所带的电荷，离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。2、离子交换剂的处理和保存

处理：干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，再用酸碱分别浸泡3、离子交换树脂的选择依据（四）离子交换剂的选择、处理和保存86三、离子交换柱层析的操作与应用（一）离子交换柱层析的操作1．层析柱2．平衡缓冲液3．上样4．洗脱缓冲液5．洗脱速度6．样品的浓缩、脱盐（二）离子交换柱层析的应用1.水处理2.分离纯化小分子物质3.分离纯化生物大分子物质三、离子交换柱层析的操作与应用87第五节凝胶柱层析一、凝胶层析的原理凝胶层析又称分子排阻层析、分子筛层析或凝胶过滤。它是指混合物随流动相经固定相（凝胶）的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。

固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质。又因整个层析过程一般不变换洗脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤。第五节凝胶柱层析一、凝胶层析的原理凝胶层析又称分子排88二、凝胶的种类1.葡聚糖凝胶2.琼脂糖凝胶3.聚丙烯酰胺凝胶二、凝胶的种类89三、凝胶柱层析的操作与应用（一）凝胶柱层析的操作特点1、凝胶柱层析优点：（1）分离条件温和，因此不易引起生物样品的变性失活；（2）每次分离操作之后，层析剂无需再生就可重复利用；（3）工作范围广，分离的分子质量范围可从几百到数百万；（4）设备简单，分离机理简单，易于操作；（5）样品回收率高，几乎可达100%。2、凝胶层析的缺点：凝胶层析上样量小，操作压力不能高，流速较慢。三、凝胶柱层析的操作与应用90（1）主要用于脱盐

（2）类分离

（3）分级分离

（4）生物大分子分子量的测定

（二）凝胶柱层析的特点与应用（1）主要用于脱盐

（2）类分离

（3）分级分离

（4）生物91第六节疏水柱层析一、疏水层析的原理亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团。尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。第六节疏水柱层析一、疏水层析的原理92

二、疏水性吸附剂

各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基（C3-C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。

二、疏水性吸附剂

各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用93

三、疏水柱层析的操作与应用

（一）疏水柱层析的操作特点1、层析柱的制备2、平衡3、加样与洗脱4、再生

三、疏水柱层析的操作与应用

（一）疏水柱层析的操作特点94（二）疏水柱层析的特点与应用1、疏水柱层析特点：（1）疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液；（2）分辨率很高、流速快、加样量大；（3）疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。2、疏水柱层析应用：疏水柱层析适用于分离的任何阶段，尤其是样品离子强度高时，即在盐析、离子交换或亲和层析之后用。疏水柱层析主要用于蛋白质类生物大分子分离纯化。（二）疏水柱层析的特点与应用1、疏水柱层析特点：（1）疏水柱95第七节亲和柱层析一、亲和柱层析的原理（一）配基固定化：选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的分离介质；（二）吸附样品：亲和吸附介质选择性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除；（三）样品解析：选择适宜的条件，使被吸附的亲和介质上的酶或其他生物活性物质解吸第七节亲和柱层析一、亲和柱层析的原理96

二、亲和吸附介质

用于亲和层析的理想载体常选用均一的珠状颗粒，特别是琼脂糖和交联葡聚糖，但也使用合成的聚丙烯酰胺凝胶、纤维素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。选作配基的分子必须具有适当的化学基团，该基团不参与配基与生物分子的特异结合，但是却可以用来连接配基与载体。将亲和配基共价偶联在载体的表面，即可制得亲和吸附介质。一般凝胶过滤介质均可作为亲和配基的载体来制备亲和吸附介质。

二、亲和吸附介质

用于亲和层析的理想载体常选用均一的珠状颗97三、亲和柱层析的操作与应用（一）亲和柱层析的操作特点1．基本过程（1）进料吸附（2）杂质清洗（3）目标产物洗脱（4）层析柱再生三、亲和柱层析的操作与应用98

（二）亲和层析的特点与应用

1、亲和层析的特点：在生物制品分离和分析领域有宽广的应用开发前景。由于其具有简便、快速、专一和高效等特点，亲和层析的应用十分广泛，已普及到生命科学的各个领域。2、亲和层析亲和层析的应用：（1）分离和纯化各种生物分子（2）分离纯化各种功能细胞（3）用于各种生化成分的分析检测

（二）亲和层析的特点与应用

1、亲和层析的特点：在生物制品99第八节分配柱层析一、分配柱层析的基本原理分配柱层析是利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同而使混合物得到分离。固定在柱内的液体叫固定相，用作冲洗的液体叫流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体来吸牢它，这种固体本身不起什么分离作用，也没有吸附能力，只是用来使固定相停留在柱内，这种固体叫载体。进行分离时先将含有固定相的载体装在柱内，加少量被分离的溶液后，用适当溶剂进行洗脱。在洗脱过程中，流动相与固定相发生接触，由于样品中各成分在两相之间的分布不同，因此向下移动的速度不同，容易溶于流动相中的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动就慢，因此得到分离。第八节分配柱层析一、分配柱层析的基本原理100二、分配柱层析的载体（一）硅胶吸水量为50%时仍为粉末状，当其吸水量在17%以上时，硅胶就失去其吸附作用，作为载体使用，此时硅胶层析则为分配层析。

（二）硅藻土具有微孔结构，不具吸附作用，是现在使用最多的载体。其处理和装柱方法基本同硅胶相似。（三）纤维素二、分配柱层析的载体101三、分配柱层析的固定相与展开剂（一）固定相

常用的固定相有水、各种缓冲溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及为水所饱和的有机溶剂等。有时也采用“反相层析法”，即用有机溶剂为固定相，而以水或水溶液或与水混合的有机溶剂为流动相。

（二）展开剂流动相一般用为水所饱和的有机溶剂或水一有机溶剂互溶的混合液，一般常用的流动相溶剂有石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷类、苯类等，或它们的混合物。反相层析法常用的流动相，则为正相层析法中的固定相，如水、各种水溶液（包括酸、碱、盐与缓冲液）、低级醇类等。

三、分配柱层析的固定相与展开剂（一）固定相102三、分配柱层析的基本操作（一）装柱

装柱前，将固定相与载体混合，如果用硅胶、纤维素等载体时，可以直加固定相直接混合，用硅藻土为载体先把硅藻土放在大量流动相液体中，在不断搅拌下，逐渐加入固定相。

（二）加样1、将被分离物配成浓溶液，用吸管轻轻沿管壁加到含固定相载体的上端，然后加流动相洗脱；2、被分离物溶液用少量含固定相的载体吸收，溶剂挥发后，加在层析管载体的上端，然后加流动相洗脱；3、用一块比管径略小的圆形滤纸吸附被分离物溶液，溶剂挥发后，放在载体上，然后加流动相洗脱。三、分配柱层析的基本操作（一）装柱103

四、分配柱层析的特点与应用

（一）特点：分配柱层析具有载体来源容易、分离成本低、流速快等特点,适用于分离极性比较大、在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。（二）应用：分配柱层析多用于分离亲水性的成分，如苷类、糖及氨基酸类。

四、分配柱层析的特点与应用

（一）特点：104第九节气相色谱一、气相色谱仪的结构及其工作过程（一）气相色谱仪的结构1.气路系统2.进样系统3.色谱柱4.检测器系统5.温控系统6.数据处理系统第九节气相色谱105（二）工作过程分离分析前，选择适当的色谱柱和流动相，设置好分离操作参数，打开高压钢瓶供给载气，载气经减压阀减压后，进入载气净化器以除去载气中的水分等杂质，由稳压阀和稳流阀控制载气的压力和流量，再流经进样器；试样从进样器注入，由载气携带进入色谱柱，试样中各组分按分配系数的大小顺序，依次被载气带出色谱柱，进入检测器，检测器将物质的浓度或质量变化转变为电信号，由记录仪记录，得到色谱图，并以此进行定性、定量分析。（二）工作过程分离分析前，选择适当的色谱柱和流动相，设置好分106二、气相色谱法的特点

选择性高灵敏度高分离效能高分析速度快应用范围广等特点二、气相色谱法的特点

选择性高107三、气相色谱分离条件的选择（一）固定相的选择（二）载气流速的选择（三）柱温的选择（四）进样量与进样时间的影响（五）色谱柱形、柱内径及柱长的选择三、气相色谱分离条件的选择108四、气相色谱分析方法（一）定性分析方法1.比较相对保留值2.用已知标准物增加峰高法（二）定量分析方法1．校正因子的测定2．定量方法四、气相色谱分析方法109五、气相色谱的应用

（一）应用生物科学（二）可以检测农副产品、食品、水质中残留的农药。（三）对食品中的乙醇等组分、山梨酸和苯甲酸等添加剂以及食品中的污染物进行分离分析。（四）对大气中污染成分和水质中的可溶性气体、农药、多卤联苯、酚类、有机胺等污染物进行分离分析。五、气相色谱的应用

（一）应用生物科学110第十节高效液相色谱一、高效液相色谱仪的组成及工作原理

（一）高效液相色谱仪的组成1.高压输液系统：贮液罐及流动相；高压输液泵；过滤器；梯度洗脱装置2.进样系统：包括取样、进样两个功能，有进样器进样、阀进样、自动进样器三种方法3.分离系统：包括色谱柱及柱温箱，色谱柱常用内壁抛光的不锈钢管，主要由柱管、固定相填料和密封垫组成。4.检测系统：常用紫外（UV）、二级管阵列（PDA）、荧光（FD）、示差（DRD）、蒸发光（ELSD）。5.色谱工作站：第十节高效液相色谱一、高效液相色谱仪111（二）工作原理分析或分离前，选择适当的色谱柱和流动相，设置好分离操作参数，待贮液瓶中的溶剂经脱气、过滤后，打开高压泵，冲洗色谱柱，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器（进样器）把样品注入进样口，流经进样器的流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分从色谱柱流出后依次流入检测器的流通池，检测器把组分浓度转变成电信号，产生的电信号经过放大，被记录仪记录或经数据处理系统（色谱工作站）进行数据处理，得到色谱图。其色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。（二）工作原理分析或分离前，选择适当的色谱柱和流动相，设置好112二、HPLC的特点（一）高压（二）高速（三）高灵敏度（四）高效（五）适用范围广二、HPLC的特点113三、分析型HPLC的操作特点（一）采用小直径柱（二）低流速、低压力（三）高灵敏度（四）以分析为目的三、分析型HPLC的操作特点114

四、制备型HPLC的操作特点

（一）大直径柱（二）高流速、高压力（三）低灵敏度（四）以制备大量（大于0.1g）为目的

四、制备型115五、HPLC工作过程

取样选择方法：一般作反相；选分离模式选择柱子：选固定相粒度；选柱内径及柱效选择分离条件：调保留值、容量因子；调相邻组分分离度；控制相邻组分选择系数；调流动相流量提高柱效特殊考虑：柱温；梯度洗脱五、HPLC工作过程取样116

实验十胡萝卜素的柱层析分离

实验十胡萝卜素的柱层析分离117一、实验准备

（一）实验原理及目的1、原理本实验采用氧化铝为固定相的吸附层析。各种物质具有不同的吸附力，胡萝卜素存在于胡萝卜、辣椒等黄绿色植物中，由于在动物体内可将胡萝卜素转变为维生素A，故又称维生素A原。胡萝卜素（属多烯色素类，又可分为α、β、γ等几种类型）可用乙醇、石油醚和丙酮等有机溶剂从食物中提取出来，并能被氧化铝所吸附。由于胡萝卜素与其他植物色素的化学结构不同，它们在有机溶剂中的溶解度以及被氧化铝吸附的强度也不相同，故将抽提液进行氧化铝柱层析，再用石油醚等冲洗层析柱，即可将植物提取液中混合的胡萝卜素分离成不同的色带。同植物其他色素相比较，胡萝卜素的极性最小，吸附最差，用石油醚洗脱速度最快，故被最先洗脱下来，使胡萝卜素与其他色素分开。同时也可将胡萝卜素层析带洗脱下来进行比色定量。一、实验准备（一）实验原理及目的118

2、目的（1）了解柱层析的基本原理（2）掌握胡萝卜素分离的操作方法（二）试剂及器具1、材料新鲜红辣椒、氧化铝（Al2O3，高温烘烤除去水分，提高其吸附力）2、试剂95%乙醇、无水硫酸钠、石油醚（沸点60～90℃）、1%丙酮-石油醚液（丙酮：石油醚=1：1；体积比）、三氯化锑氯仿溶液（称取三氯化锑22g，加100ml氯仿溶解后，贮于棕色瓶中）。3、器具剪刀、研钵，层析柱（1cm×16cm）,100ml分液漏斗，量筒100ml，铁架台及蝶形夹，蒸发皿，恒温水浴，天平，烧杯、软木塞、棉花、胶头滴管、滤纸、试管2、目的119二、实验过程

乙醇石油醚蒸馏水硫酸钠红辣椒研磨研磨洗涤提取液除水上样层析收集洗脱液鉴别二、实验过程乙醇石120三、注意事项

（一）实验中一定要将新鲜红辣椒研细，以彻底破坏植物细胞，使胡萝卜素释放更完全。丙酮可增强分离效果，有利于对胡萝卜素的提取，若分离条件控制得好，可依次提取、分离得到α胡萝卜素，ß胡萝卜素、γ胡萝卜素，以及紧随其后的是辣椒红素，番茄红素及叶黄素等植物色素。（二）为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂缝和气泡，氧化铝的高度一般为玻璃柱高度的3/4，装好柱后柱上面覆一层滤纸，以保持柱上端顶部平整，若上端不平，影响分离效果而产生不规则的条带。（三）分离洗脱过程中，要连续不断加入洗脱液，并保持一定高度的液面，在整个操作中绝不能使氧化铝表面的液体流干。三、注意事项（一）实验中一定要将新鲜红辣椒研细，以彻底破坏121（四）三氯化锑腐蚀性较强，在实验过程中切勿触及皮肤。三氯化锑遇水生成碱式盐，再转变成氯氧化锑，此化合物与胡萝卜素不发生颜色反应，而出现浑浊。（五）石油醚提取液中的乙醇必须洗净，否则吸附不好，层析中色带也弥散不清。（六）层析柱底部棉花的用量不宜过多，松紧要适宜，否则将影响流速。（四）三氯化锑腐蚀性较强，在实验过程中切勿触及皮