载体系统课件

第六节载体系统1质粒载体2噬菌体载体3cosmid克隆载体4噬菌粒载体5酵母人工染色体载体6细菌人工染色体载体1质粒载体1.1质粒的一般生物学特性1.2基因工程中的质粒载体1.3pBR322质粒载体1.4pUC质粒载体1.5穿梭质粒载体1.6质粒载体的稳定性问题1.1质粒的一般生物学特性1.1.1质粒的概念质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb以上不等。(4)已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。(5)复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质；(6)常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（scDNA型）开环DNA（ocDNA）线性DNA（cccDNA）环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型1.1.3质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。1.1.4质粒给宿主细胞的标记

(1)氨苄青霉素(Ampicillin)

(2)卡那霉素(Kanamycin)

(3)四环素（Tetracycline）

(4)氯霉素(Chloramphenicol)

(5)链霉素（Streptomycin）(6）潮霉素（Hygromycin）1.1.6质粒DNA的转移质粒的类型据能否自我转移可分为:

接合型（conjugativeplasmid)

非接合型（non-conjugativeplasmid)(2)F质粒(fertilityfactor)

F+又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相应的F–又叫雌性细胞。

F质粒(约94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式：①

F+②F`③Hfr。1.2基因工程中的质粒载体1.2.1两个概念克隆载体(cloningvector)

:

使目的片段能在细菌细胞中复制的载体;表达载体（ExpressionVector）:

使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。1.2.3表达载体的必备条件(1)能自主复制(2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记(3)具有能为

RNA聚合酶识别的强大启动子(4)启动子应可受诱导调控(5)具有强终止子(6)具有翻译起始信号1.2.4天然质粒用作载体的局限性天然质粒相对分子质量拷贝数单一酶切位点选择性标记复制类型pSC1015.8×1069.09kb1~3EcoRItetr严紧ColE14.2×10620EcoRI大肠杆菌素松弛RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr松弛局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适1.2.5质粒载体的选择标记常用的选择标记：

抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。选择标记的应用：利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。1.3pBR322质粒载体pBR322质粒载体的形体图pBR322质粒载体的优点：♣具有较小的相对分子质量(4363bp)♣具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号(Ampr和Tetr)♣具有较高的拷贝数（15个,松弛型）DNA连接酶pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应pUC18pUC19含四个部分：（1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）；（2）ampr;（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列；（4）多克隆位点（MCS）lacZ`OriAmprMCSBlueWhiteampramprInsertInsertNoinsertLacZ`LacZ`1.5穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体其它重要的质粒载体改造过的质粒载体非常多1.6质粒载体的稳定性问题（1）不稳定性类型♣分离不稳定性♣结构不稳定性（2）影响稳定性主要因素♣新陈代谢负荷♣拷贝数差度2噬菌体载体2.1噬菌体的结构及其核酸类型2.2噬菌体的生命周期2.3λ噬菌体载体2.4M13噬菌体载体2.1噬菌体的结构及其核酸类型不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。

三种不同基本类型：♣无尾部的二十面体型♣具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）♣线状体型T2噬菌体结构示意图

♣双链线性DNA（最常见）

♣双链环形DNA♣单链环形DNA♣单链线性DNA♣单链RNA噬菌体的核酸：2.2噬菌体的生命周期（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）（1）烈性噬菌体的生活周期t=0噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入；t=1寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭；t=2第一个噬菌体mRNA开始合成；t=3细菌DNA开始降解；t=5噬菌体DNA合成开始启动；t=9“晚期”噬菌体mRNA开始合成；t=12出现完整的头部和尾部结构；t=15出现头一个完整的噬菌体颗粒；t=22细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒E.coliT4噬菌体的生命周期（以分钟记）裂解循环溶源态（2）温和噬菌体的生活周期cIORPRPLOL基因早期左向转录早期右向转录基因λ噬菌体的阻遏-操纵基因系统CI=阻遏基因；P=启动子；O=操纵基因；L=左向；R=右向2.3λ噬菌体载体2.3.1λ噬菌体的分子生物学概述2.3.2λ噬菌体载体2.3.1λ噬菌体的分子生物学概述λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。注意λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因（OL,OR)之间的相互作用来决定的。如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源周期。λ噬菌体DNA的核酸内切限制酶的限制图（Kb）2.3.2λ噬菌体载体

主要有如下特点：(1)筛选简便；(2)可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10kb左右；(3)转化效率高。λ噬菌体载体可分为：

插入型载体

替换型载体注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：38kb~52kb。体外包装：λ噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。4M13噬菌体载体

6.4kb单链环状正链DNA基因组。作载体的优点：(1)单链DNA噬菌的得制,是以双链环形DNA为中间媒介,这种复制形式的DNA,可以同质粒DNA一样,在体外进行纯化和操作；(2)RFDNA和SSDNA都可感染E.coli，产生噬菌斑；(3)无包装限制问题（可6倍于M13基因组）；(4）易测出外源DNA的插入方向；(5）可产生能直接测序的单链DNA分子。5cosmid克隆载体cosmid（cossite-carringplasmid）

人工构建的含有λDNA的cos（cohesive-endsite)位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。pHC796.4kb柯斯质粒载体pHC79的形体图由pBR322质粒DNA与λ噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成部分柯斯质粒的基本特性柯斯质粒载体的特点：（1）具有λ噬菌体的特性（但因不含λ噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）；（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达45kb左右）；（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。广泛应用于基因组DNA文库的构建。柯斯克隆（cosmidcloning）理论依据是：1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。(如EcoRI)38kb~52kb应用柯斯质粒作载体构建基因组文库的一般程序四噬菌粒载体（phagemidvector)由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）噬菌粒质粒单链噬菌体辅助噬菌体大肠杆菌寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101πVXM13M13变异株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue几种常用的噬菌粒载体的一般特征pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构（1）无辅助噬菌体时pUC18/pUC19的复制亲本pUC质粒（2）有辅助噬菌体时pUC18/pUC19的复制M13开辅助噬菌体的基因组pUC18/pUC19噬菌粒载体的两种复制模型噬菌粒载体的优点（1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA，可克隆高达10kb的外源DNA；（2）有ampr等基因作为选择记号；（3）拷贝数高；（4）存在多克隆位点,可克隆达10kb的外源DNA；（5）可用组织化学显色反应筛选重组子；（6）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制；（7）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。

(8)可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。(yeastartificialchromosome,YAC)真核生物染色体的几个最为重要的部位：①端粒重复序列（telomericrepeat，TEL）

②着丝粒（centromere，CEN）③自主复制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）YAC载体的选择标记主要采用