B4 微生物实验室管理与无菌产品检验20140619课件

微生物实验室管理与无菌产品检验2014年6月E-mail:第一部分.微生物实验室的管理特点-2--3-药品微生物污染的特点微生物污染的特点是能够繁殖的活性生物数量少而且分布不均匀多数处于受损伤的状态生存环境的多样性和复杂-5-OOS结果调查和评价的复杂性微生物学检验/监测的特性检验周期长同一样品无法用于重复检测样品/环境中微生物恢复生长的影响因素较多分析人员有可能引入污染微生物微生物分析结果的差异性大-6-困境-7-对质量人的未来期望摘自PDAJournal角色转换–质量专家今天面临的挑战-8-微生物实验室质量管理要素通常包括以下内容人员设施与环境检验方法及其验证设备试剂和试液标准品测量的溯源性抽样样品的处置污染废弃物的处理文件管理变更管理异常或超标结果的处理质量系统的内审和外审-10-检验过程的影响因素人检验员、实验室管理人员机检验设备物试剂、溶剂、标准（对照）品、培养基、容器具（试管、滴定管等）法标准、操作规程、记录环实验条件-12-微生物实验室质量控制

-设施和环境基本原则方便、快捷、顺畅最大程度防止微生物的污染防止检验过程对环境和人员造成危害.-14-微生物实验室基本设施设备洁净室及（或）无菌隔离系统净化工作台各种实验用仪器设备特定的温控设施培养箱（或室）冷藏箱（或室）、冷冻箱-15-微生物实验室基本设施设备灭菌（消毒）设备湿热、干热及UV辅助性设施试剂、耗材及样品等的存贮培养基、试剂等的配制器皿、环境的清洁与消毒人员休息、办公区-16-工作类型样品检验原辅料微生物限度检查、灭菌前药液微生物污染水平检查、无菌检查、细菌内毒素检查环境监测微生物鉴别OOS结果调查容器密闭完整性的微生物挑战实验其它菌种管理、培养基制备、生物指示剂测试、日常管理-17-无菌检查的环境条件无菌检查实验应在无菌条件下进行。为此，实验环境必须适合于进行无菌检查实验。所采取的防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出无菌检查实验用设施对检品所带来的微生物学挑战性不得高于无菌工艺生产设施进行实验所需要的无菌条件可以通过位于B级洁净室内的A级单向流空气装置，或者通过隔离器来达到-18-无菌检查实验方法薄膜过滤法（首选）所适用的样品包括水溶液供试品、可溶于水的固体制剂供试品、ß-内酰胺类抗生素供试品、非水溶性制剂供试品、可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品、无菌气（喷）雾剂供试品、具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品等直接接种法所适用的样品包括混悬液等非澄清水溶液供试品、固体制剂供试品、非水溶性制剂供试品、敷料供试品、肠线、缝合线等供试品、灭菌医用器具供试品、放射性药品等-20-无菌检查结果的观察与评价按中国药典附录ⅪH规定，符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的-21-细菌内毒素检查法凝胶法凝胶限度试验凝胶半定量试验光度测定法终点浊度法和动态浊度法终点显色法和动态显色法测定结果有争议时，以凝胶法为准-23-灭菌前产品的微生物学取样正常取样时机临灭菌前的样品在灌封的开始、中间、结束3个阶段分别标记出现异常情况的样品比如，停电或超出工艺时限分批，增补样品留取备份样品-24-检验方法：灭菌前产品的总需氧菌检测检测方法薄膜过滤法–0.45μm滤膜，TSA培养基对LVP产品，检验量通常不低于100ml/容器培养条件30-35℃，逐日计数纠偏标准通常总需氧菌数控制在1000CFU/容器-26-制定和实施系统的环境监控方案完整的环境监控方案监测项目，包括空气悬浮粒子、空气浮游菌、空气沉降菌、设备表面微生物、人员卫生状况监测监测限度取样位置和取样计划现场监测方法和结果记录微生物鉴别和数据的趋势分析（年度回顾审核）其它（偏差调查与纠偏措施，人员培训、环境再验证等内容）-27-微生物常规鉴定步骤首先掌握菌株的基本特征，如细胞的形状、革兰氏染色及其他形态学特征；营养类型、需氧性等生理生化特征在此基础上查阅分类（鉴定）手册，确定菌株属于哪一大类（群、组），进行特征测定根据测定结果逐步缩小菌株的归属范围，初步确定科、属如菌株需鉴定至种，则进一步测定种的鉴别特征如鉴定结果涉及新的分类单元，则进行包括基因型在内的全面鉴定-28-微生物鉴别技术的进展快速鉴定技术PCR-SSCP、DDGE、REAL-TIMEPCR、LAMP、FT-IR快速表型鉴定系统BIOLOGAutomaticIdentificationSystem，APIIdentificationSystem，VITEK，VIDAS菌株遗传型鉴定系统DiversiLab，Riboprinter，MicroSeq采用快速检测方法的益处快速检测方法至少能够做到…推进工艺开发

提高检验速度

原辅料，成品利于过程控制

建立关键工艺步骤的控制点提早发现严重性污染避免不合格中间产品的放行增加环境监测的有效性-30-快速检测方法在环境监测中的应用空气浮游菌快速检测仪-31-快速检测方法在环境监测中的应用空气浮游菌快速检测仪测试原理新陈代谢产物荧光激发波长范围NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)340nm(300nm-410nm)Riboflavin(核黄素)400nm(320nm-420nm)-32--33-技术展望–快速检测系统示例-34-第三部分风险控制-35-岗位培训的基础内容基础培训包括GMP、安全、环保、清洁生产等通用规范微生物的安全操作实验室一般性技术GMP对微生物室的要求常用灭菌方法和原理洁净区的环境控制药典规定的无菌检查法、微生物限度检查法、抗生素微生物检定法、细菌内毒素检查法等检验技术微生物基本鉴别技术特殊设备的使用方法-36-洁净室的使用管理经设计、施工、确认合格的洁净室使用管理建立使用登记册建立洁净室使用标准操作规程HVAC系统的维护执行清洁消毒程序定期进行环境监测定期再验证定期更换紫外灯管限制无关人员的进入日常维护性检查-37-仪器设备分类管理无需校验的设备涡旋搅拌器、震荡器、真空泵、蠕动泵、光学显微镜需要定期校验的设备天平、pH计、分光光度计、浮游菌采样仪、空气粒子计数器需要验证的设备超净工作台、生物安全柜、温控设备、高压灭菌柜、去热原烘箱、微生物自动鉴别系统、微生物快速检测系统设备分级预修管理-38-标准品管理标准品的种类抗生素标准品标准菌株生物指示剂细菌内毒素标准品-39-标准品管理标准品的通用控制来源保管存储领用使用销毁定期抽样检查-40-标准菌株传代方法复溶菌粉，转种于适当的培养基内（G1），复壮;转接至平板，培养，得G2;确认菌种的纯度及理化鉴别挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管G2，同时挑取纯菌落转接斜面菌种作为工作用菌种W3冷冻保存G2，将工作用菌W3于适当温度下培养适当时间后可用于试验；取G2一支，接种于平板和斜面培养基上，制成G3和W3；冷冻保存G3,将生长、转种后的G2菌种经灭菌处理后丢弃;当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：W3可直接转接为W4;（谨慎采用）重复上述程序，直至G4转为W5为止。-41-中国药典规定的标准菌株枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[CMCC（B）63501]金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CMCC（B）26003]生孢梭菌Clostridiumsporogenes[CMCC（B）64941]铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC（B）10104]大肠埃希菌Escherichiacoli[CMCC（B）44102]白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC（F）98001]黑曲霉Aspergillusniger[CMCC（F）98003]-42-欧洲药典规定的标准菌株需氧细菌金黄色葡萄球菌ATCC6538,CIP4.83,NCTC10788,NCIMB9518,NBRC13276枯草芽孢杆菌ATCC6633,CIP52.62,NCIMB8054,NBRC3134铜绿假单胞菌ATCC9027,NCIMB8626,CIP82.118,NBRC13275厌氧细菌梭状芽孢杆菌ATCC19404,CIP79.3,NCTC532,ATCC11437,

NBRC14293真菌白色念珠菌ATCC10231,IP48.72,NCPF3179,NBRC1594黑曲霉菌ATCC16404,IP1431.83,IMI149007,NBRC9455-43-美国药典规定的标准菌株需氧细菌金黄色葡萄球菌ATCC6538,CIP4.83,NCTC10788,NCIMB9518,NBRC13276枯草芽孢杆菌ATCC6633,CIP52.62,NCIMB8054,NBRC3134铜绿假单胞菌1ATCC9027,NCIMB8626,CIP82.118,NBRC13275厌氧细菌梭状芽孢杆菌2ATCC19404,CIP79.3,NCTC532,ATCC11437,NBRC14293真菌白色念珠菌ATCC10231,IP48.72,NCPF3179,NBRC1594黑曲霉菌ATCC16404,IP1431.83,IMI149007,NBRC94551铜绿假单胞菌可用藤黄微球菌（kocuriarhizophila）ATCC9341代替。2梭状芽孢杆菌可用不产芽孢的普通拟杆菌（Bacteroidesvulgatus）ATCC8482代替。-44-生物指示剂对特定灭菌工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂。多为芽孢类细菌组成形式孢子条孢子悬浮液自含型生物指示剂-45-生物指示剂的确认包装完整保存在原包装袋中，未受光、毒性物质、过热和潮湿的影响标签内容全面（适用范围、有效期、关键参数）生物指示剂的孢子数量宜控制在104-109之间复核数量应在标示量的50%-300%之间-46-生物指示剂的确认纯度形态特征和生化特性等都应与相应的菌落形态一致耐受性(根据需要及实验室能力来定)D值实测值与标示值间不得过±20%,各测定值间差异不得过±10%-47-培养基的质量控制培养基的配制培养基质量控制培养基的灭菌培养基的贮存培养基建立质量控制程序-pH无菌性灵敏度外观检查验证的条件贮存-温度-有效期按处方/说明书配制-容器-配制用水验证和监控灭菌程序-灭菌条件-装载方式-48-试剂试液的质量控制选用适宜的试剂标签内容完整配制记录储存条件使用期限试剂

试剂名称

试剂批号

配制过程及体积

配制人及复核人-49-传统检验方法验证要素验证试验用挑战微生物涵盖范围广，包括：Gram+、Gram-、酵母和霉菌控制菌检查方法要采用相应的控制菌生产环境中常见的分离菌（依检验目的而定）注意试验菌株生理条件的一致性-50-传统检验方法验证要素检验条件检验的设施、设备、器具和材料验证试验与日常检验一致样品的处理培养培养基培养条件-51-快速检测方法验证不同微生物检验类型验证参数参数定性检验定量检验准确度-+精密度-+专属性++检测限+-定量限-+线性-+范围-+耐用性++重现性++-52-通用的验证模式用户需求(即目标)功能设计详细设计--技术上如何实现实体完成功能试验启动性能试验项目实施PQOQIQ设计确认工厂验收-52--53-快速检测系统的性能确认耐用性：考查培养时间和染色时间的影响重现性：考查不同批次培养基、过滤膜、试剂的影响准确度、精密度、线性、范围、定量限、专属性比较替代方法和药典方法差异统计学工具正态分布检验方差分析两样本t检验F检验形成URS文件的过程第一步–重新审视当前传统方法-54-检验量产品是否带有抑菌性常见污染菌工艺关注的污染菌培养基的种类每天样品数每次检验成本样品的准备时间样品的培养时间验证要求对快速方法的期望时间污染菌的鉴别要求形成URS文件的过程第二步–URS文件形成原则与目的区分强制要求与期望要求提供快速检测系统的特定要求服务于以下过程供应商选择与确认项目风险评估形成功能说明文件形成硬件与软件说明文件快速系统的确认-55-形成URS文件的过程第三步–URS文件内容举例-56-介绍目的基本信息系统的主要功能技术要求安全要求外观和材质控制系统包装和运输文件要求培训要求验证要求售后服务与维护要求……-57-微生物的常见控制手段广义的控制手段灭菌化疗消毒防腐-58-洁净室常见微生物葡萄球菌链球菌假单孢菌芽孢杆菌棒状杆菌微球菌痤疮丙酸杆菌……

-59-洁净室常见微生物曲霉菌属青霉菌属芽枝霉属白色念珠菌毛霉菌帚霉菌……

-60-消毒方法化学方法利用化学药物杀灭病原微生物。用于消毒的化学药物称为化学消毒剂。物理方法利用物理因素杀灭或清除病原及其它有害微生物。包括热力学、紫外线辐射、电离辐射、超声波、微波、等离子体方式。-61-消毒效果的影响因素微生物污染程度（种类、数量）消毒剂的种类和配方处理剂量（浓度、时间）作用温度和相对湿度

pH值有机物化学拮抗物质-62-化学消毒剂的作用机理作用部位消毒剂细胞壁甲醛、次氯酸盐、汞剂细胞膜，引起细胞点位势变化苯胺类和六氯酚类细胞膜的酶，影响电子转运途径六氯酚类作用于ATP洗必泰和过氧乙烯类作用于含硫基的酶类过氧乙烯、戊二醛、过氧化氢、碘剂和汞剂影响细胞渗透酒精、洗必泰、季铵盐类-63-化学消毒剂的作用机理作用部位消毒剂细胞质洗必泰、乙醛、六氯酚类、季铵盐类核糖体过氧化氢、汞剂核酸次氯酸盐含硫醇基团过氧乙烯、戊二醛、过氧化氢、汞剂、次氯酸盐含氨基基团过氧乙烯、戊二醛、次氯酸盐全面氧化过氧乙烯、戊二醛、次氯酸盐-64-三步消毒法清洁避免消毒剂失效，确保消毒剂与微生物的充分接触清洁剂与消毒剂的兼容性消毒

拖洗法、擦拭法：适用于平整表面喷洒或喷雾法：适用于高处、管道、复杂设备清除残留去除残留、避免影响工艺过程确保充分的接触时间避免产生二次污染-65-消毒的注意事项清洁流程的方向从最清洁区域到最脏的区域从顶部到底部从最关键表面到最不关键的表面使用方式擦拭或喷洒

擦拭方式：格栅式、拉下然后提起式、交叉抹拭、画8字形（也称为S型）或单向拖把擦拭方式-66-消毒剂效力验证考虑要点基于消毒剂本身的消毒能力进行评价选择合适的试验方案审计生产/供应商-67-消毒剂效力验证验证过程消毒剂的效力确认包括两方面内容，实验室考察和现场考察现场考察通过监测清洁/消毒前、后的环境微生物学质量进行的。经历一段时间的积累后才能用以评估消毒和清洁程序的数据（建议至少三次试验）在最差条件下(如预防性维修之后)检测环境的污染状况-68-消毒剂效力验证实验室消毒剂效力确认方法悬液定量法载体法硬面测试法-69-硬面测试法-70-第四部分案例–思考-71-案例1–检验结果超标微生物检验结果超标有以下三种原因实验室偏差与生产工艺无关的偏差与生产工艺相关的偏差-72-实验室偏差调查示意图检验结果超标仪器＆设备人员失误培养基污染环境条件培训HEPA操作服更换供应商灭菌釜失误疲惫操作泄漏无合格证破裂试管-73-无菌检查试验结果阳性的常规调查程序实验室初步调查针对以下因素检验用设施设备与检验环境监测数据实验准备、操作或样品培养中是否有明显的人为差错阴性对照试验结果是否呈阳性实验室初步调查结论如果有上述一种或几种情形出现，则定为明显的实验室偏差反之，进入调查的第二阶段-74-无菌检查试验结果阳性的常规调查程序实验室深入调查分离并鉴别污染菌如果是最终灭菌工艺产品，则考查阳性污染菌对灭菌工艺的耐受性审核检验及实验记录，找出存有潜在偏差可能的实验步骤回顾灭菌前半成品（或过滤前药液）的微生物污染水平对最终灭菌工艺产品，检查灭菌釜冷却用水含菌量数据实验室近期相关数据趋势分析实验室相关记录调查-75-无菌检查试验结果阳性的常规调查程序生产过程调查审查批生产工艺记录，调查有无异常情况发生审查近期生产环境监测资料，进行趋势分析审查人员卫生状况监测数据对于无菌工艺产品，回顾培养基灌装记录其它调查，如清洁消毒、