光合作用研究理论与实践课件

光合作用研究理论与实践工程师：姚广Tel：05388-241341Fax：E-Mail：Web:

光合作用的意义光合作用研究的理论基础第三章：叶绿素荧光目录第二章：基于O2释放的光合作用研究第一章：基于CO2吸收的光合作用研究光合作用的意义3光合作用在维持地球上O2和CO2的的平衡中起关键作用地球CO2浓度的变迁

光合作用研究的理论基础ATP+NADPH筛管和韧皮薄壁细胞种子果实或储存器官蔗糖光合作用全过程暗反应筛管和韧皮薄壁细胞种子果实或储存器官蔗糖运出细胞基于CO2吸收的光合作用研究第一章水分利用效率

(WaterUseEfficiency)WUE水分利用效率(WUE)：是指植物蒸腾消耗单位重量的水分所同化的CO2

的量，常用净光合速率与蒸腾速率的比值表示

WUE=Pn/E水分利用效率主要应用：植物的抗旱研究中，比较相同产物下，植物需要水的量气孔限制值的计算：Farquhar&Sharkey(1982):只有当细胞间隙CO2浓度降低和气孔限制值升高时，才是气孔限制。(FarquharGD,SharkeyTD,AnnRevPlantPhysio,1982,33:317-345)气孔限制值主要应用：水分胁迫等逆境条件下分析光合降低的原因Sharkey的方法：L=1-A/A0

A：为有气孔阻力时的光合速率，A0：为气孔阻力为0时的光合速率Berry的方法：L=1-Ci/CoCi：细胞间隙CO2浓度，Co

：外界CO2浓度2光合作用的日变化Diurnalvariationofphotosynthesis

光合日变化的曲线在农学，园艺等和产量相关的专业广泛应用光合作用日变化测定时需要注意的问题：1选择完全晴朗的天气（多云，大风天气适合测定）；2测定过程完全自然条件，不控光，不控温，不控湿度；3不是同一天测定的数据之间不能进行比较。不同展开程度大豆叶片的光—光合响应曲线（JiangCD，2006EEB）3光-光合响应曲线测定光补偿点饱和光强表观量子效率AQY暗呼吸速率通过光响应曲线得出以下重要参数光补偿点和饱和光强是区分阴生和阳生植物的重要参数;AQY反映植物光能利用率和光抑制的指标。光-光合响应曲线测定时需要注意的问题：1选择完全晴朗的天气，材料在光下进行充分的光启动；2测定光-光合响应曲线时从高光强到低光强测定，光强测定顺序：1800、1500、1200、1000、800、600、400、300、200、100、50、0μmol·m-2·s-1；3每个光强下要稳定1-2分钟。4CO2-光合响应曲线测定不同节位大豆叶片的CO2—光合响应曲线CO2补偿点CO2饱和点CE羧化效率CO2-光合响应曲线测定时需要注意的问题：1选择完全晴朗的天气，材料在光下进行充分的光启动；2测定光-光合响应曲线时从低CO2浓度到高CO2浓度测定，测定顺序：50、100、150、200、300、400、600、800、1000、1200、1400、1600μmol·mol-1；3CO2-光合响应曲线作图是要用Ci对Pn作图4CO2-光合响应曲线作图标准差要注意☆☆☆CO2-光合响应曲线作图是要用Ci对Pn作图Back5温度-光合响应曲线测定高温补偿点低温补偿点光合最适温度通过温度响应曲线得出以下重要参数：以上参数是反应植物生态适应的重要参数，可以为引种和育种以及分析植物的起源地提供理论依据。温度-光合响应曲线测定时需要注意的问题：1选择完全晴朗的天气，材料在光下进行充分的光启动；2温度响应曲线测定从高温到低温还是从低温到高温呢？？？36湿度-光合响应曲线测定7群体光合速率的测定光合产物的消耗

植物单叶的光合速率并不一定与植物群体的生产力成正比。作物的经济产量取决于光合性能的五个方面：光合速率

光合面积最适叶面积指数光合时间增加有效光合时间光合产物的分配

不同品种形成的三种典型群体结构小偃54小偃81对照品系冠层封闭型

冠层半封闭型

冠层开放型开放式同化室

密闭式同化室

CPY-3型群体同化室

CPY-4型群体同化室

群体光合测定时需要注意的问题：1选择完全晴朗的天气，群体光合往往也测定日变化，因此全天晴天很重要；2群体光合操作需要多人配合完成（尤其是大型同化室）；3群体光合（密闭式）测定测定时间不能过长，否则会在同化室壁上产生气雾，同时CO2浓度会下降；4测定过程中一定要密封好严防漏气；更多细节问题可登陆博客：5不能测定响应曲线，可以测定日变化。8光合作用启动过程的研究充分暗适应的野生大豆光合幼叶和功能叶启动过程光合启动可以研究林下植物对光的利用，为什么有的品种可以在林下生长，有的不能在林下生存。9光呼吸的研究逆境条件下，光呼吸可以起到保护做用，测定光呼吸往往用来研究植物的保护机制。光呼吸的测定

配气方法：低氧空气：（2%的氧气，380ppmCO2）普通空气：（21%的氧气，380ppmCO2）测定同一片叶片在不同氧含量下的光合速率光呼吸（Pr）=Pn2%-Pn21%10呼吸速率的测定☆形状规则叶片呼吸速率测定

☆果实、种子、花卉等不规则形状样品呼吸速率测定

☆土壤呼吸速率测定

规则叶片呼吸速率测定

Back与测定光合的方法类似，直接用黑布将叶室遮住即可，或者将光源的光强设置为“0”自制的开放式呼吸室果实、种子、花卉等不规则形状样品呼吸速率测定

Back土壤呼吸速率测定

nCO2+nH2O(CH2O)n+nO2

光叶绿体2.氧电极测定O2的变化，计算光合速率。（放氧速率）

光合仪测定的理论基础:2.氧电极测定O2的变化，计算光合速率。（放氧速率）

光合仪测定CO2的变化，计算光合速率；（CO2的同化速率）光合仪测定CO2的变化，计算光合速率；（CO2的同化速率）基于O2释放的光合作用研究第二章光合电子传递链Clark电极的工作原理：氧电极的构造叶片茎芽藻类Clark电极（氧电极）可以用来研究：☆光合放氧☆呼吸耗氧及状态呼吸的测定☆光系统的活性光合放氧过程以测O2法（放氧速率）测定的光—光合响应曲线Back光合电子传递链光系统II（PSII）活性的测定1,4-BQDPC2H2O4H++O2光系统I（PSI）活性的测定DPIC+ASAMVO2H2O2Back呼吸放氧过程呼吸耗氧及状态呼吸的测定ⅠⅡⅢⅣP/O：加入ADP后，出现状态III，ADP和消耗氧的比值呼吸控制率（R·C）：状态III和状态IV的比值；反映线粒体的氧化磷酸化机能，即线粒体的完整性。叶绿素荧光第三章Chla荧光研究叶绿素荧光透射光下反射光下叶绿素荧光现象

Kautsky等（1931）发现，将暗适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光,称为Kautsky效应。叶绿素荧光的基本原理时间（min）Fluorscence

在生理温度下，叶绿素荧光的波长峰值大约为685nm的红光，并且一直延伸到800nm的远红光处。光波长比较长的光

当叶绿素分子吸收光能后，叶绿素分子中的电子被激发，激发态电子的寿命非常短，当电子从激发态回到到基态的去激过程中，一小部分激发能（约3%）以红色的荧光形式耗散。

荧光是研究光能分配的探针：激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢

通过调节PSII反应中心的开放的程度干涉荧光的发射，根据不同情况下荧光的变化来分析光合机构运行情况。1、叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程的丰富信息●光能的吸收与转换●能量的传递与分配●反应中心的状态●过剩光能及其耗散●光合作用光抑制与光破坏……等等2、可以对光合器官进行“无损伤探查”，获得“原位”的（insitu）信息。3、操作步骤简单快捷，一次测定获得的数据量大。叶绿素荧光动力学研究得到广泛应用的原因FMS-2脉冲调制式荧光仪连续激发式荧光仪（HandyPEA）Fo：初始荧光产量（Originalfluorescenceyield）也称基础荧光，是PSⅡ反应中心（经过充分暗适应以后）处于完全开放状态时的初始荧光产量。常用荧光参数及其意义一般认为，这部分荧光是天线中的激发能尚未被反应中心捕获之前，由天线叶绿素发出的。当反应中心失活或者遭到破坏时，Fo上升。已知过高的温度往往使PSII放氧复合体脱离，反应中心失活。此时Fo会明显提高。

●基础荧光参数：因此，可以用Fo随温度的变化动态来反映高温对光合器官的危害，用来评价植物的抗热性。Fm：最大荧光产量（Maximalfluoreseenceyield），是PSⅡ反应中心完全关闭时的荧光产量。通常叶片经暗适应30min后测得。Fm’：光适应下最大荧光。Fo’：

光适应下最小荧光。Fs:稳态荧光steady-statefluorescenceyield。光照下，光-暗反应达到动态平衡时的荧光产量●

荧光淬灭参数：qP=(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’)：photochemicalquenching光化学淬灭系数，它反映了PSⅡ反应中心的开放程度。1-qP用来表示PSⅡ反应中心的关闭程度。qNP=(Fm-Fm’)/(Fm-Fo’)：非光化学淬灭系数NPQ

=(Fm-F’m)/F’m＝Fm/Fm’-1：非光化学淬灭non-photochemicalquenchingFv/Fm：暗适应下PSⅡ反应中心完全开放时的最大光化学效率，反映PSⅡ反应中心最大光能转换效率。Fv’/Fm’：光适应下PSⅡ最大光化学效率，它反映有热耗散存在时PSⅡ反应中心完全开放时的光化学效率，也称为最大天线转换效率。

●

反映PSII光化学效率的荧光参数：ФPSⅡ=(Fm’-Fs)/Fm’：PSⅡ实际光化学效率，它反映在照光下PSⅡ反应中心部分关闭的情况下的实际光化学效率。（△F/Fm’）ETR

=0.5×α×ФPSⅡ×PFDPSII电子传递速率

其它荧光参数及其意义qE：高能态荧光淬灭（依赖于跨膜质子梯度）qT：与状态转换相关的荧光淬灭（捕光色素复合体与PSII分离）qI：与光抑制相关的荧光淬灭（由于产生光抑制引起的荧光淬灭）●

区分过剩光能耗散不同方式的荧光参数：●

ФPSII（Ф

II）+ФNPQ+Ф

NO

=1ФPSII：实际光化学效率（光化学量子产额）ФNPQ：包括天线耗散和反应中心的失活ФNO：非光诱导的淬灭●表示光合电子传递去向的荧光参数：Je(PSII)=α×ФPSⅡ

×PFD；单位时间内通过PSII的全部电子流

α=4×(A+Rd)/(PFD×φPSII)Je(PCR)=4(A+Rd)/(1-pO2/(2×Sr

×CC));用于碳同化的电子流Je(PCO)=4(Vc×pO2)/(Sr×CC);用于光呼吸的电子流Ja

=Je(PSII)-Je(PCR)-Je(PCO);用于PCR和PCO以外途径的电子流Ja(2%O2)=Je(PSII(2%O2)

)-Je(PCR(2%O2)

)-Je(PCO(2%O2)

);用于氮同化途径的电子流Ja(21%O2)-Ja(2%O2)；用于Mehler反应的电子流叶绿素荧光在生理研究中的理论基础●光合作用的能量利用效率；●过剩光能的耗散；●光合作用的光抑制，光破坏；●光破坏防御机制等。

叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程丰富的信息，我们常说荧光是研究光能分配的探针。对于生理生态研究者，主要兴趣集中在：1光对于与植物是一把“双刃剑”

光是绿色植物光合作用的唯一能量来源，是植物赖以生存的基础。然而，当植物吸收的光能超过其利用能力时，将出现光能过剩。过剩的激发能在光系统内积累，会导致活性氧的产生，引起光合作用的光抑制，甚至光氧化、光破坏。2什么情况下植物容易受到过剩光能的伤害呢？各种逆境胁迫条件下（高温、低温、干旱、盐胁迫、渗透胁迫等）；在弱光下生长的植物或者阴生植物突然暴露在强光下；衰老的叶片。●

光照过强

中午强光；苗期和冠层植被的上部叶片，平展叶片●

同化能力弱或者碳同化受到抑制时3光能过剩的后果●光抑制（photoinhibition）——植物在强光下光化学效率下降的现象常用Fv/Fm的降低来表示植物叶片的光抑制

光抑制一是植物的保护性反应的表现，是对过剩光能进行“无害化处理”（主要是热耗散）的结果，可以较快恢复；二是产生光破坏。光抑制并不必然伴随光合速率的下降。●光破坏（photodamage）当强光与其他逆境同时存在，过剩光能大大超过光合器官进行“无害化处理”能力的情况下，将产生光破坏。常见的光破坏表现：

如PSII中D1蛋白的降解；叶绿素降解导致的“光漂白”等，光破坏多半难以恢复。以上情况都可以反映到叶绿素荧光动力学参数的变化上来。

光破坏现象4光合机构如何处理过剩激发能？——防御光破坏的三道防线●第一道防线：天线热耗散（又称“高能态耗散”）此类热耗散依赖于：（1）类囊体膜内外的pH梯度（非环式电子传递、假环式电子传递和环式电子传递均可加大pH梯度）（2）叶黄素循环

天线热耗散的最大特点是在过剩光能尚未引起PSII反应中心电荷分离之前，就在天线中将其耗散，这种对过剩激发能处理的方式：一是安全可靠二是反应快速主要是通过PSII反应中心的可逆（或不可逆）失活，使一部分PSII反应中心由原来的光能转化中心变为过剩光能耗散中心，但是，这种耗散方式实际上已经使一部分PSII复合体受到暂时的或永久性的损伤。是光抑制的狭义的概念。●第二道防线：反应中心耗散用荧光动力学曲线区分过剩光能耗散的不同方式可将非光化学猝灭qNP区分为三部分：qNP＝qE+qT+qIqE－高能态荧光猝灭qT－与状态转换有关的荧光猝灭qI－与光抑制有关的荧光猝灭

通过以上两道防线仍未被耗散掉的激发能，可能在PSII中转移给O2而形成单线态氧，或以激发态电子的形式在PSI受体端交给O2而形成氧自由基O2-这时便需要通过酶促的或非酶促的途径将活性氧加以清除。●第三道防线：活性氧清除

Mehler过氧化反应（水水循环）

SODAPXO2O2.-

2O2.-+2H+

O2+H2O2;2H2O2O2+2H2O以上三道防线可以对过剩激发能进行层层阻截，以减轻其危害。但是，当强光与多种逆境同时存在、这三条途径未能奏效的情况下，将不可避免地产生大量活性氧，造成光破坏。最常见的结果D1蛋白的破坏，更加严重的是叶绿素和类胡萝卜素的降解，使叶片发生“光漂白”。荧光动力学在逆境研究中的应用举例1Fv/Fm常用来研究光抑制的程度图示：不同展开程度的大豆叶片荧光参数Fv/Fm的日变化●：33%○：78%▼：100%2Fo常用来研究高温对光合机构的危害对照叶片和盐胁迫叶片光化学猝灭系数（qP）、PSII光能捕获效（Fv’/Fm’）、PSII实际光化学效率(ФPSII，)、非光化学猝灭(NPQ，D)对温度的响应。示NaCl处理增加叶片的抗高温能力

○，对照；●，200mmol/LNaCl

3用叶绿素荧光反映胁迫条件下受伤害的程度Fig.EffectsofCaCl2supplementonphotochemicalquenching(A),efficiencyofexcitationenergycapturebyopenphotosystemII(PSII)reactioncenters(B),quantumyieldofPSIIelectrontransport(C)andnonphotochemicalquenching(D)incontrol(s)and200mMNaCl-treated(d)Rumexleavesat600mmolm22s21photosyntheticphotonfluxdensity,360mmolmol21CO2and25C.田间玉米品种果穗叶与叶黄素循环有关的能量耗散（qE）在衰老过程中的变化4用叶绿素荧光分析叶片衰老过程中过剩光能耗散的不同方式田间玉米品种果穗叶与状态转换有关的能量耗散（qT）在衰老过程中的变化

田间玉米品种果穗叶与光抑制有关的能量耗散（qI）在衰老过程中的变化不同年代玉米品种果穗叶光化学效率（ΦPSⅡ）在衰老过程中的变化

盐击过程中光合速率（Pn，▲）和PSII光量子效率（ΦPSII，■）的变化21%O22%O2▲:净光合速率■:PSII实际光化学效率盐击盐击5盐击过程中电子传递过程的研究

21%O2(◆)和2％O2(■)条件下，盐击过程中气孔导度、光化学猝灭系数、PSII反应中心光能捕获效率和非光化学猝灭的变化A:气孔导度（Gs）B：光化学猝灭系数（qP）C：光能捕获效率（Fv’/Fm’）D:非光化学猝灭系数（NPQ）◆：21%O2■：2％O2

盐击过程中21%O2通过PSII的电子流(Jf,

)、光合以及光呼吸消耗的电子流(Jg,□)、Mehler反应消耗的电子流(Ja,▲)的变化

：通过PSII的电子流(Jf)□：光合以及光呼吸消耗的电子流(Jg)▲：Mehler反应消耗的电子流(Ja）6叶绿素荧光的启动过程1不了解各基本参数的测定条件荧光使用过程中的常见问题举例暗适应后测定的参数：Fo；Fm（计算出来的Fv；Fv/Fm）光适应下测定的参数：Fo’；Fm’；Fs（计算出来的ФPSII；Fv’/Fm’；qP；NPQ；ETR等）2参数Fv/Fm使用中常见问题Fv/Fm:PSII的最大光化学效率。

中度高温、低温、盐胁迫后Fv/Fm没有明显变化说明逆境没有影响PSII的活性。Fv/Fm:在非胁迫条件下，Fv/Fm的值很稳定，据Bjorkman&Demmig对大量植物的测定，其平均值为0.832±0.004，但在逆境条件下，Fv/Fm显著降低，因此，Fv/Fm常作为发生光抑制或者PSII受到伤害的指标。？？？

单一的高温、低温、盐胁迫等逆境不一定会对PSII产生伤害，然而自然界并非都是单一逆境，高温、盐胁迫等的出现往往伴随着强光，逆境+光才会导致Fv/Fm的明显降低。

Fv/Fm常被作为光抑制的指标

近来的研究表明，环境胁迫对PSII的伤害取决PSII蛋白复合体于破坏和修复的速度，逆境并不加速PSII蛋白的破坏而是抑制其修复的速度。TakahashiS,MurataN.Howdoenvironmentalstressesacceleratephotoinhibition?TrendsinPlantScience,2008,13(4)3ФPSII使用中常见问题A测定数据错误B测定结果重复性不好，标准差很大ФPSII是光下实际光化学效率，是在光下测定。切忌在光强不稳定的培养箱，人工气候室内测定。ФPSII必须在稳定的光强下测定，光强变，ФPSII就变。不同光强下测定的数据不能进行平行比较。100元花80元花钱效率0.8

1000元花500元花钱效率0.5

100μmol·m-2·s-1利用80实际光化学效率ФPSII0.8

1000μmol·m-2·s-1利用500实际光化学效率ФPSII0.5

ФPSII4颠倒因果关系，将荧光参数ФPSII降低一律当做是光合降低的原因净光合速率Netphotosyntheticrate(µmol.m-2.s-1)气孔导度Stomatalconductance(mmol.m-2.s-1)对照（CK）NaCl处理（NaCl）12.3±1.5a7.6±0.4b145±9a90±3b5ETR使用中的注意事项电子传递速率：ETR=1/2×α×PFD×ФPSII

α：叶片的吸收系数≈0.84PFD：光通量密度（光强）ФPSII：光系统II的实际光化学效率ETR=1/2×α×PFD×Ф

PSII/8＞Pn(在相同光强下的比较)nCO2+nH2O(CH2O)n+nO2

光叶绿体CO2固定光呼吸N代谢S代谢8e6将荧光参数和产量挂钩ΦPSIIPnETR

光合速率并不一定与植物群体的产量成正比。作物的经济产量取决于光合性能的五个方面。A光合速率B光合时间C光合面积D光合产物的分配E光合产物的消耗7NPQ和ΦPSII以相同规律变化A衰老或者严重的逆境胁迫下，植物叶片已经接近死亡的时候；B测定有误。8Fo，Fm等参数使用的问题如参数Fv/Fm、ФPSII、NPQ、Fv’/Fm’、qP等都是计算出来的参数，都是比值。同型号的仪器，以相同的方法测定，系统误差会比较小。参数Fo和Fm是直接的仪器监测出来的荧光信号，和设定的光强，叶片距探头的距离以及测定的叶面积直接；仪器的光源老化程度，光纤老化程度以及检测器等相关，因此，这些参数的测定必须用同一个仪器。9直接用Fv/Fm反