分子生物学10课件

第十章分子生物学的研究方法

本章概要：生物大分子的分离，标记示踪剂，核酸杂交，转录子的作图和定量分析，体内测定转录速率，DNA和蛋白质的相互作用，基因工程的基础和原理。第一节生物大分子的分离琼脂糖凝胶电泳

DNA凝胶电泳。由于DNA带有磷酸基团，DNA通常带有负电荷，所以DNA在凝胶中是从负极向正极移动的。由于DNA分子大小不同，小分子DNA在凝胶中移动时受到的阻力要比大分子DNA小，所以电泳结果DNA按其分子大小分布。通过荧光染料将DNA染色，就可以在紫外光照射下观察凝胶上DNA的分布情况。未知分子量大小的DNA通过和已知标准分子量大小的DNA一起凝胶电泳，然后观察比较它们在凝胶上的位置就可以判断未知DNA分子量大小。同样的凝胶电泳分离原理也适用于RNA。聚丙烯酰胺凝胶电泳

在蛋白质的分离中，电泳所用的凝胶通常是聚丙烯酰胺。

如果要测定某一个酶的组成多肽，就需要用某种方法将这个酶的组成多肽（也称为亚基）分开再进行电泳。通常使用去垢剂（十二烷基磺酸钠，SDS）使这个酶变性从而将其亚基彼此分开。

二、双向凝胶电泳

双向凝胶电泳（twodimensionalgelelectrophoresis,2-DE）可以提高单向变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析能力。双向电泳由于具有高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。双向电泳的第一向电泳是等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)，然后通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)对蛋白质进行第二向电泳；在IEF中，蛋白质因等电点不同而被分离；在SDS－PAGE中，不同分子量的蛋白质相互间被分离开，再用考马斯亮兰或银染进行检测，经Pdquest等软件对结果进行比对、解析。

离子交换剂是通过化学反应将带电基团引人到惰性支持物上而形成的，如带电基团呈正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂(anionexchanger)。由于被分离的各种离子所带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有差异，因此经过不同浓度离子的交换与洗脱过程，使不同的离子依先后顺序被洗脱下来，从而达到分离目的。同样原理，也可以用带有负电荷的离子交换树脂来对包括蛋白质在内的带有正电荷的物质进行分离。离子交换层析中，基质上带有负电荷的基团，称之阳离子交换剂（cationexchanger）。第二节标记示踪剂精确检测DNA片段中放射性的量通过观察放射自显影条带的深浅来粗略估计，也可以用光密度计扫描放射自显影条带进行准确估计。

磷光成像(phosphorescenceimaging)

的工作原理在于：同位素标记的杂交结果在磷屏上曝光，曝光是32P等核素核衰变同时发射β射线，首先激发磷屏上分子，使磷屏吸收能量分子发生氧化反应，以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。激光扫描磷屏，对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应，即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放，从而被探测器捕获进行光电转换，磷屏分子回到还原态。二、磷光成像

计算机接受电信号，经处理形成屏幕图像这是一个伪彩色图，不同颜色代表不同的放射性强度，从最低的黄色到最高的黑色。磷光成像灵敏度较X光片高数十倍，可以检测最弱的信号。X光片的最大饱和度在10,000dpm（disintegrationsperminute，射线每分钟衰变次数），所以一条50,000dpm的条带与一条10,000dpm的条带看起来是没有差别的。而磷光成像检测的是放射性强度，所以10,000dpm与50,000dpm之间的差别是很明显的。三、液体闪烁计数液体闪烁计数（liquidscintillationcounting,LSC）就是利用放射性同位素发出的射线与物质相互作用，从而直接或间接地产生电离和激发等效应，产生能被光电倍增管检测到的光子。四、非放射性示踪

放射性示踪剂最大的优点就是灵敏度高，不过现在很多非放射性示踪剂(non-radioactivetracer)也有了很高的灵敏度，而且免除了放射性示踪剂造成的放射性污染和对人体的危害。目前最常用的非放射性示踪剂是生物素和地高辛Detectingnucleicacidswithanonradioactiveprobe.一、DNA印迹杂交Southernblot是研究DNA图谱的基本技术，用于基因组DNA特定序列定位。Southern印迹杂交基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定后即可用于杂交。

二、DNA指纹和DNA分型这种DNA分型的方法是由AlecJefferys和他的同事们在1985年发现的，他们在研究一段来源于α球蛋白基因的DNA片段时发现这个片段含有一段重复多次的序列，这种重复的DNA被称为微卫星DNA（microsatelliteDNA）。每一个人的这些序列的重复方式都是不一样的，两个人有相同序列重复方式的几率是极微的，它们像指纹一样具有唯一性，因而又称为DNA指纹（DNAfingerprint）。

DNA分型（DNAtyping）技术，又称DNA指纹技术，是对人类基因组中具有多态性的重复序列进行基因分型的技术。

四、原位杂交原位杂交（(insituhybridization,ISH）是让细胞中的染色体扩散，使DNA部分变性产生能与标记探针杂交的单链，通过染色确定染色体所在，而通过放射自显影确定目的基因所在，从而确定目的基因在哪一条染色体上。将DNA探针用能被荧光抗体检测的二硝基酚标记，可以确定肝糖磷酸化酶基因位于人11号染色体上，染色体用碘化丙啶（PI）染色，发出红色荧光；而以红色为背景，位于11号染色体上的抗体探针的黄色是很明显的。这种使用荧光标记探针的技术就是荧光原位杂交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）。

五、定点突变定点突变（site-directedgenemutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

第四节转录子的作图和定量分析分子生物学的一个任务是转录子（mRNA）的作图（定位起点和终点）与定量分析（测定一定时间内的转录数量）。除了Northernblot以外，还有多种方法进行酶切作图和定量分析。一、S1作图

S1作图（S1mapping）是采用S1核酸酶对RNA进行作图的方法，用于定位RNA的5’-和3’-末端以及定量分析一定时间内细胞中的某种RNA。原理：标记一条能够和目的转录产物杂交的单链DNA探针，而不是标记转录产物本身，探针必须包含转录产物起点或终点的序列。探针与转录产物杂交后，使用S1核酸酶消化单链DNA和RNA。因此，转录产物保护探针的一部分不被降解。

凝胶电泳能测定这部分的大小，通过被保护部分的范围就能确定转录产物的起点和终点。与转录产物杂交的DNA探针部位被保护，包括末端标记。探针被保护部分的大小可根据凝胶电泳已知片段大小的markerDNA来判断。探针的右末端（标记的BamHI）位置已清楚，被保护的探针长度就能说明左末端的位置，即转录起始位点。S1作图同样可以用于定位转录产物的3’-末端。S1作图不仅可以定位转录末端，还可测定转录浓度。

S1mappingthe5′-endofatranscript.S1mappingthe3′-endofatranscript.二、引物延伸引物延伸（primerextension）的方法能准确测定5’-末端（而不是3’-末端）的核苷酸。转录一般发生在体内，首先可以收集细胞总RNA，其中包括了需要对其5’-末端作图的序列已知的转录产物，然后，用标记的至少12nt的寡聚核苷酸（引物）与细胞总RNA杂交（通常使用至少18nt的引物）。

用DNA复制所需作图的RNA。一旦引物扩增完成后，使RNA-DNA杂交链变性，在高分辨率凝胶中将标记的DNA与markers一起电泳。引物延伸分析可用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类，非常适合于对单个基因作定量和定性分析。三、Run-off转录和G-lesscassette转录Run-off转录（Run-offtranscription）能更快速地得到突变基因的启动子对转录正确性和效率的影响。G-lesscassette转录（G-lesscassettetranscription）是run-off体外精确转录的另一种检测方法。G-lesscassette是位于非模板链上缺乏G残基的一段核酸（365nt）。当polymerase进行转录时，按照DNA模板链转录出与编码链相同的序列(T->U)。在这个G-lesscassette过程中，编码链就是双链DNA上方那股（也就是最接近"G-lesscassette"的部分)，而进行转录时RNApolymerase读该股的互补股(也就是下方那股)，所以到最后RNApolymerase读到的是ACG（也就是TCG的互补股），因而当polymerase读完A（输出T）到C时，没有“GTP”作为材料所以就run-off了。第五节体内测定转录速率一、细胞核持续转录技术细胞核持续转录技术(nuclearrun-ontranscription)的重要原理是将细胞核从细胞中分离出来，在体外继续延伸早先在体内已经开始的转录。二、报告基因转录另一个体内测定转录的方法就是将一报告基因（reportergenetranscription）置于特定的启动子之下，然后检测这种报告基因产物的积累情况。比如，想检测一个真核启动子的结构情况，可以突变包括这一启动子的DNA区域，然后将这一突变DNA导入细胞检测突变体对启动子活性的影响。可以用S1作图或是引物延伸分析来做这个检测，也可以用报告基因替代原始基因，检测报告基因产物的活性。报告基因产物极易检测，比S1作图和引物延伸要容易的多。

chloramphenicol(CAM)第六节DNA与蛋白质的相互作用

一、滤膜结合法滤膜结合法(membranebindingassay)的原理是硝酸纤维素滤膜可以结合蛋白但不能结合双链DNA，如果蛋白质与双链DNA片段相结合，则这一结合物仍可结合在滤膜上。实验过程是先将纯化的蛋白质同双链DNA在适当的缓冲液中孵育，一段时间后将混合液通过滤膜进行抽滤，这样没有和蛋白质结合的DNA就可以通过滤膜，而已结合的则被留在滤膜上，这样就可以直接测定两者之间的相互作用。（a）双链DNA流过滤膜，（b）蛋白质结合在滤膜上，（c）标记的双链DNA先与蛋白质孵育，DNA-蛋白质复合物滞留在滤膜上。二、凝胶迁移率变化实验凝胶迁移率变化实验（gelmobilityshiftassay）又叫凝胶滞留法（gelretardationassay），是一种简单、快速而灵敏的检测特异性DNA序列结合蛋白的方法，是研究序列特异性DNA结合蛋白的常用方法。原理是当DNA结合蛋白与特异性的DNA序列结合形成DNA-蛋白质复合物时，DNA所带的电荷与相对分子量均发生了变化，其迁移率也发生了变化，在聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）中的迁移率大大降低，比游离的DNA片段要慢的多，这样，如果标记特异性DNA，通过放射自显影就可清楚显示出不同的条带。三、酵母双杂交系统酵母双杂交技术(yeasttwo-hybridtechnology)是20世纪90年代初期发展出来的一种用于研究蛋白质相互作用的方法手段，它利用酵母细胞内的真核表达系统，将两种外源蛋白质的基因分别与酵母转录因子的两个功能结构域融合，通过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型的改变作为外源蛋白是否发生相互作用的筛选标志。真核生物许多转录因子有两个结构域组成，N端结构域识别基因上游特异的DNA序列，称为DNA结合域（DNA－bandingdomain,DNA－BD）;C端的结构域具有激活转录的功能，称为转录激活域（activationdomain,AD）两个结构域连接在一起，并结合到DNA上时才能激活转录。

四、DNaseI

足迹试验、

硫酸二甲酯足迹试验

DNase足迹法（DNaseIfootprintingassay）的技术原理是被DNA结合蛋白所结合的DNA将不再被随机切割DNA的DNaseI所降解。蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。DNase足迹法是一种十分有效的测定DNA上蛋白结合位点的实验方法。足迹试验的方法较多，常用的除了DNaseI足迹试验外还有硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate,DMS)，两者原理基本相同。硫酸二甲酯是最常用的烷基化试剂探针，因为它分子较小可以自由地出入细胞膜和细胞核膜，从而甲基化基因组DNA，可以弥补Dnase足迹试验的不足。五、免疫共沉降免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatinimmuno-precipitationassay,CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。ChIP-chip技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。第七节基因敲除技术

前面讨论的技术主要是研究特定基因的结构和活性，但是在此之前首先要知道这个基因在生命活动中有何功能，基因敲除（geneknockout）就可以做到这一点。基因敲除是MarrioCapecchi于八十年代末在Utah大学发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。基因敲除是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因目的的一种技术。实验的动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠（knockoutmice)。第八节基因工程

(geneengineering)基因重组

是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆

将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程

实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。基因工程包含三个要素：载体、工具酶和表达系统（原核或真核宿主细胞）其技术路线大致包括几个程序：①目的DNA片段的分离制备；②目的片段与载体的体外重组；③将重组的DNA分子转化到表达系统中；④筛选、鉴定重组DNA分子

本章主要内容一、基因克隆常用的载体二、重要的工具酶三、基因工程基本原理四、基因工程的应用

一基因克隆常用的载体载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA。

本节主要内容载体必须具备的基本条件载体的种类常用的载体（一）载体必须具备的基本条件⒈有自身的复制子，能独立复制⒉具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)⒊具有遗传表型或筛选标记⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段。⒌表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。⒍载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入该非必需区，而载体本身不受影响。（二）载体的种类*1、克隆载体

用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性：⑴能够在受体细胞复制；⑵带有药物抗性基因，便于筛选；⑶可导入受体细胞。2、表达载体除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。（三）常用的载体

A、质粒(plasmid)：

是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。

作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选3.具有多克隆位点

总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：

pBR32质粒、pUC系列等

pBR322质粒①4363bp②含一个复制点含一个抗氨卞青霉素标记(ampR)④一个抗四环素标记(tetR)⑤ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外原基因插入抗药基因位点时，AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).pUC系列质粒

由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampr和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断,编码半乳糖苷酶T载体：T载体是一种克隆载体，常用于PCR产物连接，它不能大量表达，T载体自身为线性，在其3’末端具有突出的T粘性末端。B、表达载体表达载体（expressionvectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。C、λ噬菌体组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。

λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长

溶菌性生长（lyticpathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。

溶源性生长(lysogenicpathway)噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。

λ噬菌体两种生长途径（示意图）D、粘粒(cosmidvector)（30~50kb）

是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30~50kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。

F、大片段DNA克隆载体

人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。1、细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）

优点：能携带大片段DNA，约300kb。

在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，Ecoli中的F因子。此质粒含有2种基因（partA,partB）。每个Ecoli能接受>300kbDNA片段。2、噬菌体PI载体和PAC

PI噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110~115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统PAC。3、酵母人工染色体

（yeastartificialchromosome,YAC）适用于克隆大片段DNA，0.2~2Mb。YAC的主要功能成份有三：

着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。

二、重要的工具酶工具酶

基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。（一）限制性核酸内切酶(RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。

根据限制酶的作用特性，一般分为三类：——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或钝端

回文序列是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;

粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的碱基序列相互具有互补性。⑴产生5'-粘性末端

⑵产生3'-粘性末端⑶产生平(头末)端/钝端其它特殊性质的Ⅱ型限制酶同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶同裂酶

又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。同裂酶——同识同切同裂酶——同识异切同尾酶

同尾酶

指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。可变酶可变酶

识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。

常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ（二）DNA聚合酶

（最常用的DNA聚合酶有以下4种）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶1、DNA聚合酶Ⅰ

E.Coli

DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：

5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性

5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性

3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性DNApolⅠ应用⑴催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵第二条cDNA链的合成；⑶对DNA3’突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移2、Klenow片段（DNApol.大片断）

Klenow片段用途⑴补齐双链DNA的3ˊ末端；⑵用标记碱基补齐3ˊ末端；

⑶在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；⑷DNA序列分析。3、TaqDNApol（耐热DNA聚合酶）

作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075℃，2）95℃以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。（三）逆转录酶

特点

逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。

逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。（四）DNA连接酶(DNAligase)

DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。

DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA连接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修补带有缺口的双链DNA分子T4DNA连接酶（五）碱性磷酸酶

碱性磷酸酶(BAP)能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。用途⒈制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。⒉用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。（六）末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)

作用

将标记或未标记的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用①探针标记

P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32

②在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接重要的工具酶工具酶活性限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNAT4DNA连接酶催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA逆转录酶以RNA为模板合成DNA碱性磷酸酶切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶

催化3'-端合成同聚体尾

三、基因工程基本原理（DNA重组基本程序包括下列过程）

分—获取目的基因和载体接—目的基因与载体的连接转—重组DNA导入宿主细胞筛—重组DNA的筛选与鉴定1、获取

DNA重组基本过程2、重组3、转化4、筛选5、克隆6、表达表达产物分离纯化（一）目的基因的获取（分）目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。

目的基因来源

1）制备基因组DNA2）制备cDNA3）聚合酶链反应4）人工合成基因（1）制备基因组DNA（基因文库）分离、纯化基因组DNA

条件：温和，在EDTA或SDS等存在下

↓RE用蛋白酶K消化细胞、酚抽提大小不同酶切片段

片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离

↓分别与同样RE消化的载体连接常用噬菌体载体或质粒载体

↓DNA连接酶连接。

导入细胞进入宿主细胞内培养扩增。

↓

筛选鉴定用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。（2）制备cDNA（cDNA文库）（1）合成cDNA第一条链反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。引物是与mRNA3ˊ端polyA互补的寡聚dT（12～18dT片段）（2）合成cDNA第二条链RNase去掉模板mRNA（3）构建cDNA文库①cDNA两端加接头或衔接头接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。②cDNA与载体相连。③导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。（二）制备cDNA（cDNA文库）

分离目的基因的mRNA逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解回折处单链得到平端双链cDNA导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库（3）聚合酶链反应(PCR)

在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下，体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因（见18章）。

（4）人工合成基因

引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。

一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段。（二）目的基因与载体的连接（接）

（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接2）平头末端连接3）人工接头法4）同源多聚尾连接法

（1）粘性末端连接

将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。

（2）平头末端连接

某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。（3）人工接头法合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。（4）同源多聚尾连接法（三）重组DNA导入宿主细胞（转）

无性繁殖

体外重组后的DNA导入受体细胞，形成转化子。然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。克隆

从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞

进行无性繁殖时所采用的受体细胞.

重组DNA导入宿主细胞的类型转化以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。

感受态细胞

用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。（四）重组DNA的筛选与鉴定（筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法）

1）平板筛选2）限制酶切图谱筛选3）PCR筛选重组体4）原位杂交技术插入失活蓝－白筛选（一）平板筛选

是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活

当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。

抗生素平板筛选（插入失活）（2）蓝-白筛选

它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。

载体：编码β-半乳糖宿主：编码β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列α-互补细菌表达：β-半乳糖苷酶活性蛋白↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成蓝色菌落当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。

（IPTG存在下）

蓝－白筛选示意图2.限制性内切酶图谱鉴3.PCR筛选重组体

抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析。4.原位杂交技术（五）重组体在宿主细胞中的表达和调控

基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。

克隆基因表达有三个条件

⑴基因的编码区不能被插入序列所中断;

⑵基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA聚合酶有效地识别;

⑶mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外

源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。四、基因工程的应用

（一）疾病基因的发现

1990年美国科学家首先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成；

2001年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因；整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。

人类基因组图谱的初步完成，不仅