《制药业灭菌工艺的验证与监控》教学课件

制药业灭菌工艺的验证与监控主要内容2主题1.灭菌工艺的重要性主题2.药品生产中的灭菌方式主题3.

灭菌设备确认与工艺验证主题4.参数放行的定义主题5.参数放行的技术基础主题6.参数放行实施展望3主题1.灭菌工艺的重要性药害事件与GMP的发展cGMP的诞生与发展4药害事件中的产品特点成分复杂对质量要求高劣质产品具有致命性患者在使用前无法确定药品的质量案例分析1901年，接受白喉抗毒素治疗的儿童死于破伤风。起因是用于制备抗毒素的马血清被破伤风梭菌污染。51970年10月和1971年4月，美国疾病控制中心（CDC）报告有败血症流行，该病的流行与静脉输液药剂有关。该中心报告说：截至到1971年3月6日，在美国7个州中的8家医院里发现有150例细菌污染病例。一周以后，败血症的病例升至350例。到1971年3月27日则达到405人。美国1976年的统计数字表明，前十年内因质量问题从市场撤回输液产品的事件超过600起，造成410人受到伤害，54人死亡。案例分析（续）1972年，英国，德旺波特事故英国德旺波特医院输液灭菌过程不力而导致污染，造成至少5例败血症患者死亡的事故。消毒柜的排气阀已被碎玻璃和纸团堵塞，导致在灭菌时，消毒柜内的空气无法顺利排出，局部空间达不到预定灭菌温度温度记录仪损坏在取样和检测方法上存在失误未按照书面规程操作灭菌釜设备维修保养存在缺陷6-7-无菌药品按照生产工艺可分为两类采用最终灭菌工艺的最终灭菌产品部分或全部采用无菌生产工艺的非最终灭菌产品-7-无菌药品的生产方式-8-最终灭菌工艺高洁净环境控制灭菌前微生物污染在密封容器中最终灭菌无菌生产工艺极高洁净环境组成材料分别灭菌在密封容器中无进一步灭菌处理两种生产方式的差别无菌药品生产的微生物学关注点-9-最终灭菌工艺赋予产品更高的无菌保证水平生产中可变因素少，出现偏差的概率低几乎能杀灭产品中的所有微生物

需要关注的微生物范围集中在具有耐受性的芽孢上面无菌生产工艺影响因素多各类微生物污染都可能导致工艺失败验证时以污染瓶数衡量无菌保证水平-10-微生物污染的来源原辅料内包装容器配料用水生产环境制造工艺操作人员Bioburden10最终灭菌产品无菌保证的主要环节11产品的无菌保证灭菌前微生物污染包装密封性灭菌工艺灭菌设备灭菌工艺验证二次污染原料设备和生产过程生产环境生产时限灭菌工艺在无菌药品生产中的应用最终灭菌产品

灌装在容器中的药品必要时，产品溶液或粉末、内包装材料、设备、管路必要时，用具、人员防护装备等12无菌工艺产品

产品的组分、内包装材料和直接接触设备

A级（或ISO5级）内，任何接近产品的材料、人员防护装备、用具等粉末模拟分装用乳糖13主题2.药品生产中的灭菌方式灭菌的主要目的

杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽胞最大限度地提高药物制剂的安全性保护制剂的稳定性保证制剂的临床疗效研究、选择有效的灭菌方法，对保证产品质量具有重要意义1415什么是微生物15从以下几方面理解微生物并不是生物分类学上的名词是包括所有形体微小的单细胞，或个体结构简单的多细胞，或没有细胞结构的低等生物的通称16微生物的复杂性16复杂性最低最高朊病毒和类病毒病毒细菌古细菌酵母菌丝状真菌原生动物植物动物微生物真核细胞原核细胞无细胞结构微生物的分类病毒细菌真菌18细菌在环境中的生存状态18活跃死亡受伤芽孢、孢囊生物膜休眠生长存活死亡细胞间的相互作用酸碱度/pH辐射温度水活度化学物质饥饿19芽孢的特性芽孢是休眠体Endospore与Exospore形成芽孢的细菌种类1920芽孢的特性细菌细胞与内生孢子的区别20特性生长态细菌细胞细菌芽孢结构细胞壁、细胞膜、原生质厚皮层、外衣和外壁显微镜下形态无折射光有折射光钙含量低高水含量高极低吡啶二羧酸（DPA）无有酶、代谢活性高低或无mRNA有无或非常低对环境胁迫条件的耐受性（物理或化学）低高小分子酸溶性蛋白无有内部pH~7.05.5~6.021芽孢的特性细菌芽孢对胁迫条件的耐受性原理21处理方式（胁迫条件）保护性因素芽孢杀灭机理湿热内核极低含水量、SASP、DPA、矿物化、热稳定性蛋白酶被灭活干热SASP，热稳定性蛋白，DNA修复酶被灭活，DNA损伤UV–辐射内核极低含水量、SASP、DPA、矿物化、热稳定性蛋白、DNA修复DNA损伤γ–辐射SASP、DPA、矿物化DNA损伤化学物质致密的皮层和内膜难以被化学物质渗透、SASP、DNA修复DNA损伤（部份）、皮层和内膜损伤或降解灭菌技术的应用历史灭菌作为工业化技术已使用了120多年1890’s–湿热(蒸汽)1890’s–干热1940’s–环氧乙烷1950’s–电子束1960’s–加玛辐射1960’s–无菌包装1970’s–美国国家标准(e.g.AAMI)1980’s–美国国家标准法制化1990’s–国际标准化组织/ISO/ENS注：无菌操作技术始于1860’s经典灭菌方法物理灭菌法利用物理方法，杀灭或截留去除微生物，亦称物理灭菌技术包括干热灭菌、湿热灭菌、除菌过滤和辐射灭菌等化学灭菌法利用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭包括液体灭菌、气体灭菌、低温蒸汽灭菌。23经典灭菌方法在制药业中的应用最终灭菌药品湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法无菌工艺药品除菌过滤法（如产品、工艺气体等）湿热灭菌法、干热灭菌法辐照灭菌法（如防护装备、滤器、一次性用具等）液体灭菌法（如某些生物制品、器械）气体灭菌法（如防护装备、滤器等）低温蒸汽灭菌法（进入隔离器的包装材料等）24合适的灭菌工艺迅速杀灭微生物，但不损害产品的用途不现实。除了那些高度稳定的材料…在杀灭微生物的同时，破坏了产品用途毫无价值

寻找平衡点在产品降解与杀灭微生物之间寻找平衡点在能够提供最低无菌保证水平的基础上，保证药品的安全性、稳定性和有效性25灭菌对产品的不利影响因素湿热灭菌－温度约为121℃干热灭菌－温度约为170℃~250℃辐射灭菌－退色、自由基、强度降低气体灭菌－残留、化学反应过滤除菌－溶出、析出、吸收液体灭菌－化学反应、高pH值、腐蚀低温蒸汽灭菌－残留、化学反应、腐蚀总而言之，对微生物的杀灭依靠恶劣条件26灭菌工艺的设计原则27产品特性法灭菌工艺过度杀灭法灭菌工艺验证时和日常灭菌前微生物监控所需要的信息量预计效期供热量上升上升下降28湿热灭菌又称为Moistheatsterilizationunderpressure细胞内起关键作用的蛋白质和酶发生热变性或凝固。湿度对该破坏性过程起促进作用。只要可能，通常取121℃（2个大气压）优点：无残留，不污染环境，不破坏产品表面，容易控制和重现性好包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽-空气混合物灭菌器、过热水灭菌器等28湿热灭菌国内外法规和指南USPISO17665ISO11138-BI,ISO11140-CIHTM2010EN554,285PDATRNo.1中国药典药品GMP指南GB8599YY0646GB18281GB/T1997229脉动真空灭菌器示意图干热灭菌原理：使微生物氧化而不是蛋白质变性，因此温度要高得多，时间也相应延长利用干热灭菌工艺灭菌温度高、时间长的特点，可使干热灭菌同时具备除热原的功用干热灭菌适用于耐高温但不适于湿热或可被湿热破坏的物品，如玻璃、金属设备、器具，不需湿气穿透的油脂类，耐高温的粉末化学药品等干热灭菌不适用于橡胶、塑料及大部分药品30干热灭菌国内外法规和指南USPISO11138-BI,ISO11140-CIISO20857PDATRNo.3PDATRNo.7中国药典药品GMP指南YY1275GB1828131气体灭菌灭菌剂的种类环氧乙烷（ETO，C2H4O）臭氧（Ozone，O3）二氧化氯（ChlorineDioxide-ClO2）气体灭菌不同于低温蒸汽灭菌32环氧乙烷灭菌原理：蛋白质上的羧基（-COOH）、氨基（-NH2）、硫氢基（-SH）和羟基（-OH）发生烷基化作用，造成蛋白质失去反应基因，阻碍蛋白质的正常化学反应和新陈代谢抑制生物酶活性，包括磷酸致活酶、肽酶、胆碱化酶和胆碱脂

DNA、RNA发生烷基化作用而导致微生物的灭活优点：高效，易于扩散，广泛的兼容性缺点：过程复杂，安全性问题，职业健康问题、环境问题影响灭菌效果的外在因素–气体浓度、温度、相对湿度、载体材料33环氧乙烷灭菌由三个阶段组成：预处理、灭菌和解析典型的环氧乙烷灭菌周期预热、抽真空、加湿、加药、灭菌34国内外法规和指南中国药典药品GMP指南GB18279USPISO11138-BI,ISO11140-CIISO11135辐射灭菌辐射类型α射线，穿透力差β射线，穿透力略强于α射线

γ射线，穿透力很强X射线，人工产生的电磁辐射电子束，可用于表面消毒（低能量）或内部消毒（高能量）电离辐射杀灭微生物的作用，可以分为直接作用和间接作用两种35辐射灭菌辐射灭菌的优点在常温下处理，特别适用于不耐热物品的处理不会产生放射性污染，灭菌后的产品无残留毒性辐射穿透力强，可深入到被灭菌物体内部，灭菌彻底，可对包装后的产品灭菌对温度、压力无特殊要求，常温常压下即可进行辐照灭菌工艺参数易于控制,易于进行参数放行，适合于工业化大生产，节约能源。36辐射灭菌国内外法规和指南ISO11737PDATRNo.11PDATRNo.16中国药典药品GMP指南GB1828037过滤除菌定义：除菌过滤是指除去流体中微生物的工艺过程，该过程不应对产品质量产生不良影响。包括液体和气体除菌过滤。药品生产中采用的除菌过滤膜的孔径一般不超过0.22μm（或者0.2μm，这两种标称没有区别）除菌级过滤器可以有不同的大小、形式和膜材，过滤器的使用者应当根据使用需要选择不同的过滤器。38过滤除菌除菌级过滤器是指在工艺条件下每cm2

有效过滤面积可以截留107CFU的缺陷假单胞菌（Brevundimonasdiminuta,ATCC19146）的过滤器。影响细菌截留效果的因素过滤器源的因素，如过滤器类型、结构、基础聚合物、表面改性化学、孔径分布和过滤膜的厚度等工艺源的因素，如流体组分、流体性质、工艺条件，产品、料液和生产环境中实际微生物污染的特点和水平等3940过滤除菌国内外指南性文件中国药典药品GMP指南YY/T0567YY/T0918PDATRNo.15PDATRNo.26PDATRNo.40PDATRNo.41低温蒸汽灭菌气体灭菌与低温蒸汽灭菌的区别气体灭菌穿透性好，分布均匀，不易受到温湿度影响低温蒸汽灭菌，两个阶段的浓度不同，条件不易控制41来自PDASterilizationTechnology低温蒸汽灭菌灭菌剂的种类过氧化氢（HydrogenPeroxide，H2O2）过氧乙酸（PeraceticAcid-C2H4O3

）甲醛（Formaldehyde-CH2O）低温蒸汽灭菌的特点室温残留，穿透性低，环境中的温湿度会有差异，工艺的均一性不好42灭菌新技术电穿孔技术（Electroporation）低温等离子体技术（Non-ThermalPlasma）超高压技术（HighPressureProcessing）43HPP处理前的嗜热脂肪芽孢杆菌HPP处理后的嗜热脂肪芽孢杆菌44主题3.灭菌设备确认与工艺验证453-1.设计阶段到验证阶段的基本要点4546项目设计-确认的一篮子计划46确认活动PQ/PV=性能试验用户技术要求

即，项目的目标？功能设计/要领设计

达到什么功能要求？性能确认试验计划运行确认试验计划安装检查计划包括管线仪表进入项目实施影响评估设计确认技术交底技术沟通及设计详细设计--

即如何从工程上实现确认活动确认活动OQ=系统/设备调试IQ=完成安装并进行检查工艺先导项目验证总计划指导设备选型工艺及设备初定灭菌设备/工艺验证生命周期的活动4747用户需求标准(URS)具体设计标准(DDS)试车(Commissioning)工厂验收测试(FAT)终端验收测试(SAT)设备静态确认(IQ)设备动态确认(OQ)设计确认(DQ)设备确认(IQ/OQ)工艺程序开发性能确认(PQ)和持续性监控功能需求标准(FRS)灭菌微生物学的基本概念无菌(Sterility)：是指产品中不存在任何活的微生物。这个绝对的概念，无法用实验来证明，不能成为工业标准灭菌工艺(Sterilization)：通过适当的物理或化学手段，将一定数量的活性微生物完全杀灭，并且使其生命活动产生了不可逆转的过程。无菌保证值（SAL）：指经灭菌后非无菌品的概率。通常为10-6或10-3（来自ISO11139）4849最终灭菌产品无菌的标准49通过物理/生物学方法证明，单位产品内微生物存在的概率不超过百万分之一(即批产品的污染概率不超过百万分之一).无菌保证值（SAL）：指经灭菌后非无菌品的概率。最终灭菌产品非无菌品的概率不超过百万分之一，即SAL≤10-650EMEA灭菌工艺决策树（适用于液体制剂）50能否耐受121℃×15分钟的湿热灭菌条件选择121℃×15分钟湿热灭菌工艺是否能否耐受F0≥8的湿热灭菌条件，以达到SAL≤10-6选择F0≥8的湿热灭菌工艺，以达到SAL≤10-6是否使用无菌过滤加无菌灌封方式是否能否经可截留微生物的过滤器对药液进行除菌过滤对原料预先灭菌，进行无菌配制和无菌灌封51EMEA灭菌工艺决策树

（适用于非溶液剂型、半固体或干粉制剂）5152灭菌方法的选择52灭菌方法的选择受灭菌对象的稳定性、使用目的和具体条件等限制，可以选择不同的方法。非产品类物质的灭菌方法，环境设施宜使用化学灭菌法处理，玻璃容器一般使用干热灭菌处理，衣物、橡胶制品等多使用湿热灭菌处理，模拟分装用乳糖则可以选择辐射灭菌处理，对制剂产品的灭菌方法的选择根据需要产品的特性进行决策53设备的安装确认（IQ）和运行确认（OQ）53安装确认（InstallQualification）证明灭菌设备安装的所有关键环节（如，设备构造、控制/监测系统、运行系统、安全系统及所有零部件）符合法规和设计要求，并根据设备生产商的建议进行。运行确认（OperationalQualification）对设备进行检查和试运行，为灭菌程序所有重要控制参数的确定提供实验依据。54灭菌工艺的验证（PQ/PV）54共同点灭菌剂分布与穿透（物理检测手段）微生物杀灭水平（生物指示剂测试）目的保证产品用途达到灭菌效果55灭菌工艺再验证的频率55定期：每年至少一次重大变更关键灭菌控制参数

装载方式

被灭菌品及其包装方式重大维修563-2.湿热灭菌工艺5657A.工作原理和工艺标准5758腔室灭菌设备－例158蒸汽－空气混和气体灭菌器59腔室灭菌设备－例159蒸汽－空气混和气体灭菌程序的温度-压力曲线图60腔室灭菌设备－例260重力置换式灭菌器工作原理1、蒸汽进入2、高温度蒸汽比重小，在上部3、蒸汽不断进入4、冷凝水及低温度空气在底部被挤走61腔室灭菌设备－例261重力置换式灭菌程序温度-压力曲线图62腔室灭菌设备－例362预真空式灭菌器此程序特别适用于对包藏或夹带空气的物品，如织物、胶管、过滤器和灌装机部件等的灭菌63腔室灭菌设备－例363高真空式灭菌程序温度-压力曲线图温度真空64腔室灭菌设备－例364脉动真空式灭菌程序温度-压力曲线图65腔室灭菌设备－例465水喷淋式灭菌器循环泵冷却水工业蒸汽灭菌柜腔室水压缩空气没标出66腔室灭菌设备－例466水喷淋式灭菌器67腔室灭菌设备－例467水喷淋式灭菌程序温度-压力曲线图68在线灭菌系统－示例68灌装线和固定罐相连接的在线灭菌系统69湿热灭菌的能量转移湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，尽管有时也采用过热水灭菌，如水浴式或喷淋式。蒸汽灭菌是一个高效的热传递方式，因为蒸汽接触温度较低的物体时，会释放潜热，生成冷凝水，直到物体温度与蒸汽温度相等。6970湿热灭菌的热力学基础70湿热灭菌的热力学基础压力-温度相图7172湿热灭菌微生物学相关术语FT：指T℃下的灭菌时间F0：指标准灭菌时间。将121℃作为标准灭菌温度，当Z设定为10℃时，灭菌程序赋予被灭菌品121℃下的等效灭菌时间。D值：在一定温度下将微生物数量杀灭90%或下降一个对数单位所需要的时间（分钟）Z值：当某种微生物的D值下降（或上升）一个对数（log）单位时，其温度应升高（或降低）的度数。7273湿热灭菌微生物学相关术语灭菌率（L，LethalRate）系指在某温度下灭菌1分钟所的标准灭菌时间(分钟)，即F0和FT的比值(L＝F0/FT)

公式：L(Tref,z)=10(T-Tref)/zT被加热的物体的实际温度Tref参照温度，通常取121℃z微生物的z值（可取10℃），指使微生物的D值变化一个对数单位灭菌温度所需调节的度数73用121℃和z取10代入，得L=1，即一个标准单位，其它温度下，可代入计算74不同温度和z值下的灭菌率T/(℃)Z＝7Z＝8Z＝9Z＝10Z＝11Z＝121000.0010.0020.0060.0080.0120.018…………………1150.1390.1780.2150.2510.2850.3161160.1930.2370.2780.3160.3510.3831170.2680.3160.3590.3980.4330.4641180.3730.4220.4640.5010.5340.562118.50.4390.4890.5270.5620.5930.6191190.5180.5620.5990.6310.6580.6811200.7200.7500.7740.7940.8110.8251211.001.001.001.001.001.001221.391.331.291.251.231.217475F0值示意图7576灭菌方式的开发与确认7677灭菌方式的选择决策树7778湿热灭菌工艺的无菌标准78原则标准--定义通过物理/生物学方法证明，单位产品内微生物存在的概率不得超过百万分之一，即批产品的污染概率不得超过百万分之一实际控制标准过度杀灭法残存概率法79药典要求EP对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件至少为121oC×15分钟；也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与上述相等效。目标：SAL=10-6或更低USP对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件需达到12D，至少为12分钟目标：使D121=1分钟，数量为106的微生物经过灭菌后达到SAL=10-6。7980灭菌工艺的开发与设计根据灭菌前带菌量进行设计（产品特性设计法）基于对灭菌前产品所含微生物的耐热特性和数量以及产品的热稳定性灭菌后产品的污染概率须小于10-6。过度杀灭法基于工艺程序能杀灭更加耐热微生物，并且再加上一定的安全系数；对生物指示剂孢子的杀灭能力更高。工艺选择兼顾产品的热稳定性和无菌要求。8081湿热灭菌中的微生物死亡模式实验表明，在恒定的灭菌温度下，同一种微生物的死亡遵循一级动力学规则，其死亡速率是微生物的耐热参数D和杀灭时间的函数，与灭菌程序中微生物的数量无关。可用下面的半对数一级动力模式表示：LgNF=LgN0

-F(T,z)/DT

NF灭菌F分钟后，微生物存活的数量F(T,z)灭菌程序在T℃和温度系数z下的等效灭菌时间DT微生物在T℃下，下降一对数单位所需的时间。说明：该特定温度必须与F值计算中所采用的温度相一致N0初始微生物的数量8182B.设备确认要素8283从设计到确认的简化模式83用户需求(即目标)功能设计--确定要哪些功能详细设计--工程上如何实现完成建设功能试验启动性能试验项目实施PQOQIQ设计确认工厂验收84灭菌设备的用户需求（原则）需要思考的问题工艺的要求是什么（即达到怎样的灭菌效果）？灭菌对象：固体物品？液体产品？还是用于消毒和灭菌带生物污染的垃圾？最大灭菌物品的尺寸及可能的装载密度？对灭菌柜的具体要求（如有关运行/控制方面）?8485灭菌设备的用户需求（原则）关注要点安装部位和维修空间工艺要求控制系统使用效率8586灭菌设备的用户需求（示例）工艺要求

腔室体积，内架车层数；腔室工作压力；设备运行时间；是否需要使用脉动真空程序；腔体内温度的分布均匀性；双扉灭菌柜应有门互锁功能；设备具有良好的密闭性…安全要求

故障检测和报警功能；设备安全罩配备，电气控制柜配有安全锁；工作噪声要求；急停按钮；断电保护…安装环境要求8687灭菌设备的用户需求（示例）公用系统要求

压缩空气；纯蒸汽；工业蒸汽；冷却水；电力要求外观及材质要求自控系统要求

PLC自动控制，触摸屏控制；数据存储；具有自动记录打印功能，记录数据传感器和控制所用传感器不是同一个；程序参数可调；三级密码权限管理；可选择“中文”；控制模式包括“自动”和“手动”；预留通信接口文件与服务要求其他要求8788建造和测试程序8889灭菌设备的确认活动清单（示例）89

中外存在差异90灭菌设备的确认活动清单（示例）9091灭菌设备的确认活动清单（示例）9192设备的性能确认（PQ）要素试车（空载热分布试验和/或满载热分布试验）92温度探头10-20支，探头精确度±0.15℃须有探头与腔室原探头并列放置检测报警和安全系统的可靠性真空系统的可靠性（产生的效率、维持时间等）灭菌温度下，各点间最大温差（腔室内的）<=2℃，同一点的最大温差±1.0℃重复试验至少3次以证明重现性93C.工艺验证要素9394灭菌工艺的验证（PV）要素每种装载方式下的热穿透试验证明特定灭菌程序杀灭微生物的均一性和有效性;证明灭菌程序的重现性和稳定性;证明灭菌程序对被灭菌物品的适用性。容器内部产品的热穿透试验证明在每种装载方式下：各点温度分布的均一性、灭菌结果的重现性;证明最冷点达到了设定效果。94高中低95PV常用BI形式生物指示剂试验结果与热穿透试验保持一致所有测试点均应确保SAL不低于10-6试验次数足以符合统计学要求（至少重复3次试验，试样数为10–20支/次）9596灭菌程序杀灭力的表述生物杀灭力（FBiological）用以证明灭菌程序杀灭效果的标准BI制剂试验结果可直接反映灭菌效果有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入)局限性：较难进行统计学分析物理杀灭力（FPhysical）长期的试验确立了标准灭菌时间Fo与微生物杀灭的效果的相关性，因此，人们常将它作为评价标准精确测定热分布和热穿透状况，用于计算不同灭菌程序的灭菌效果测量数据便于统计学分析9697灭菌程序PV合格标准物理确认的合格标准(示例)如下：用热穿透探头测得超过设定温度的最短及最长时间F0的下限及上限；灭菌阶段结束时的最低F0值灭菌阶段的最低和最高压力饱和蒸汽温度和压力之间的关系灭菌阶段腔室的最低和最高温度热穿透温度探头之间的最大温差或F0的变化范围热分布试验中温度探头间的最大温差最长平衡时间；最少正常运行的探头数9798灭菌程序PV合格标准-续生物确认合格标准（示例）：微生物挑战试验中，孢子的对数下降值符合预期标准规定的阳性和阴性对照符合设定要求应在灭菌程序性能确认中进行必要的论证，证明FPHY和FBIO间大体上一致（基本一致：F生物可能小些，F物理可能大些）

98选用BI的注意事项只能采用芽孢来做湿热灭菌程序的挑战性试验：纯度要求--这些孢子必须达到一定的纯度（基本没有生长态菌或微小的残骸和团块等）稳定性好--有确定的耐热特性（不应有大的波动）有合法来源--其母代菌株应该从公认的菌种库购买挑战试验中，所选用生物指示剂的接种量应比产品或其它装载的生物负荷高生物指示剂的耐热性应比生物负荷强99100湿热灭菌验证常用的BI在过度杀灭程序的确认中，最常采用BI：嗜热脂肪芽孢杆菌/Geobacillusstearothermophilus，前称Bacillusstearothermophilus；也可采用其他对湿热灭菌耐热性强的微生物。在采用“残存概率法”确认中，典型的BI有：Clostridumsporogenes（生孢梭菌，梭状芽孢杆菌

）Bacillusatrophaeus（萎缩芽孢杆菌）Bacillussmithii（史密氏杆菌，前称凝结芽孢杆菌）Bacillussubtilis（枯草芽孢杆菌5230）100对市销售BI的确认进行形态学和纯度确认(至少鉴别至菌属)芽孢计数复核蒸汽灭菌工艺用BI，95-100℃下暴热预处理15分钟环氧乙烷和干热灭菌工艺用BI，80-85℃下暴热预处理10分钟预处理后迅速转移至冰水浴内合格标准：Lg(实测值)和Lg(标示值)在0.3-1.48之间D值复核(根据需要及实验室能力来定)101101生物指示剂验证-过度杀灭工艺选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂（B.stearothermophilusATCC7953被视为标准菌株D121.1=1.5分，单位数量105–106个孢子）生物指示剂与温度探头并列在同一部位(10-20支)按规定条件培养生物指示剂，如嗜热脂肪芽孢杆菌的培养温度为55-60oC，培养7天，每天检查。对生物指示剂用培养基进行促生长检查进行阳性对照试验所有经受挑战试验的样品均呈阴性102102生物指示剂验证–非过度杀灭工艺选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂生物指示剂的耐热性不得低于孢子在相应产品中的耐热性不得低于产品中污染菌的耐热性用于每次挑战试验的所有BI批号必须相同生物指示剂的接种量计算 F0=D121.1×(logN0-logNt)103103验证条件优化案例：某公司生产三种大输液产品A、B和C，与微生物相关的基本参数如右表请根据这表中参数，设计出产品灭菌程序的BI验证方案BI=生物指示剂产品ABC药液含菌量≤1000≤100≤1000D值DC≤DBIDC≤DBIDC≤DBI灭菌程序117℃×25分117℃×20分117℃×20分F09-138.5-129-13DBI0.80.90.7104验证条件优化可只选B代表三个产品，理由：生物指示剂在其中的耐热性最高，而灭菌程序的F0值下限8.5低于其它二个产品验证时，生物负荷取高限，以103CFU/瓶计算试验应证明，灭菌程序能使BI至少下降9个对数单位,所需F0为0.9×9=8.1分当F0为8.1分时，这三个产品均可达到无菌保证的要求105106标准溶液的使用要求孢子在标准溶液中的耐热性≥孢子在产品溶液中的耐热性孢子的耐热性在标准溶液中比较稳定有孢子在标准溶液中的耐热性资料标准溶液更方便于制备和检测适用于替代灭菌程序相近的不同产品的灭菌工艺验证106灭菌程序确认示例-1过度杀灭工艺期望的物理杀灭时间FPHY和FBIO均≥12分。如使用D为2.1分的BI，那么完全杀灭挑战试验中BI的最低N0可通过以下方法计算：LgN0=LgNF＋F/D=Lg100＋12/2.1LgN0=5.71；N0=5.2×105因此，能杀灭N0=5.2×105、D为2.1分的BI最低可接受灭菌程序，系经BI确认的过度杀灭程序FBIO≥12.0分107灭菌程序确认示例-2非完全杀灭终点程序。如设计要求F0为8分钟；BI接种数量N0为2×106；D为2.0分钟，则终点NF的最大值可以通过计算得到，并仍然可以保证灭菌程序赋予被灭菌品期望的FBIOLgNF=LgN0－F/D=Lg2×106－8.0/2.0（降4lg单位）LgNF=6.3－4.0=2.30；∴NF≈

2.0×102因此，如果最低合格灭菌程序MAC能使D为2分钟的BI由N0=2×106低于NF~2.0×102（终点值）时，则证明生物杀灭时间FBIO≥8分钟。108109灭菌工艺验证文件编制示例1

Purpose&Scope目的及范围2

Background背景2-1产品介绍2-2灭菌釜介绍（加热及水喷淋装置，温度控制系统）2-3装载及位置命名2-4灭菌程序2-5术语解释3

RiskAnalysis风险分析风险识别：产品内部冷热点、灭菌釜腔室内温度分布风险识别：产品热穿透、产品装载方式风险识别：挑战试验参数、生物指示剂适用性110灭菌工艺验证文件编制示例4Personnel实施人员5Calibration设备仪器校验5-1灭菌釜温度控制系统介绍5-2灭菌釜测温探头5-3验证用仪器6StandardProcedures试验规程7

ValidationMethod验证方法7-1验证策略7-2样品制备111灭菌工艺验证文件编制示例7-3样品测试a包装内热分布b满载温度分布c单车装载温度分布d最小装载热穿透e单车装载热穿透f满载热穿透g生物指示剂挑战试验8

Deviations偏差管理1123-3.干热灭菌工艺112113干热灭菌/去热原工艺的适用范围干热灭菌适用于能够耐受高温且不容易为蒸汽穿透或者容易被湿热所破坏的物料粉末油品、油脂玻璃制品和不锈钢钢设备干热灭菌需要更高的温度和（或者）更长的时间，但其工艺通常比较简单湿热灭菌的基本概念及所开发的方法，通常可适用于干热灭菌113114工艺目标目标1：干热灭菌（残存概率）根据被灭菌品的微生物污染数量及其耐热性，确立灭菌程序的相关参数目标2：干热灭菌（过度杀灭）被灭菌品的热稳定性更好采用此程序时，通常没有必要对生物负荷进行测试目标3：干热灭菌与细菌内毒素灭活去热原是最终目标赋予被灭菌品的微生物杀灭力远高于目标2114115干热灭菌/去热原工艺验证通常的物理和生物学测试顺序设备安装确认设备基本性能的确认关键传感器、监控器和控制系统的校准灭菌设备热动力学特性的确认（热分布确认）工艺的设计/工程学确认工艺的微生物学验证测试数据的回顾审核整个文件的最终批准115116干热对微生物的热致死特性干热对微生物的热致死特性与湿热相似FH值的概念与湿热灭菌中的F0值相类似，是指在某特定温度下所产生的灭菌效果与在160℃下相等效时所需要的灭菌时间(分钟)计算公式116117生物指示剂确认的意义通过生物指示剂验证确认加热介质的均匀性（温度分布）确认装载方式中升温最慢点/冷点的位置（热穿透）确认使耐干热灭菌的孢子下降12个对数单位的最小FH值（过度杀灭工艺）程序的重现性，即保证最难加热点/冷点位置始终能获得规定FH值117118干热对细菌内毒素的破坏作用基本知识点热原可以通过干热破坏通常采用非常高的温度，提供了极大的无菌安全余地应考虑到热处理之前的细菌内毒素水平对一个干热程序的去热原能力，可以通过灭活已知挑战水平的纯细菌内毒素来加以证明118119干热对细菌内毒素的破坏作用对FH值的计算公式与前述相似，以250℃作为标准温度，Z最低取46.4℃，该公式仅用于对内毒素的去除进行量化估测如果干热灭菌温度超过220℃，可以用考查细菌内毒素下降3个对数单位的方法来替代生物指示剂验证干热去热原的通常条件250℃×30min650℃×1min180℃×4hour119120主题4.参数放行的定义参数放行定义--欧洲AsystemofreleasethatgivestheassurancethatproductisoftheintendedqualitybasedoninformationcollectedduringthemanufacturingprocessandonthecompliancewithspecificGMPrequirementsrelatedtoParametricRelease.参数放行是根据生产过程中收集到的信息，以及符合GMP与参数放行相关具体要求，以保证产品符合预期的质量的放行系统。(EUAnnex17,2001)不只局限于无菌检查，可应用于成品的质量特性。121参数放行定义--美国Asterilityassurancereleaseprogramwheredemonstratedcontrolofthesterilizationprocessenablesafirmtousedefinedcriticalprocesscontrols,inlieuofthesterilitytest,tofulfilltheintentof21CFR211.165(a)and211.167(a)USFDASubmissionGuidance,2010andUSFDACPGSec.490.200,2012。能够确认制造厂采用了确定的关键工艺控制，以替代无菌检查，并保证满足联邦法规211.165(a)和211.167(a)无菌要求的放行计划/系统。只适用于无菌保证计划，重心放在灭菌工艺。122参数放行定义--全球PDA技术报告No.30--2012修订版Asterilityreleaseprogramthatisfoundeduponeffectivecontrol,monitoringanddocumentationofavalidatedsterile-productmanufacturingprocesswheresterilityreleaseisbasedondemonstratedachievementofcriticaloperationalparametersinlieuofend-productsterilitytesting.基于对经过验证的无菌产品的生产工艺的有效控制、监测并有文件记录，证明关键运行参数达到无菌放行要求，以替代最终产品无菌检查的无菌放行系统。123无菌检查与参数放行的对比按药典要求取样及检验以最终产品检验结果为依据以生产过程中收集到的信息为依据符合GMP与参数放行相关要求保证产品符合预期的质量无菌检查参数放行参数放行的界定检查无菌=>无菌检查=>等待14天等待检验结果在等待结果期间，产品压库

无菌检查有假阳性或阳性的可能，须调查检查无菌=>参数放行要求=>不需要等待即时放行在放行前，不需要作无菌检查126主题5.参数放行的技术基础1275-1.无菌保证系统127参数放行的基本概念什么是参数放行参数放行系指根据对经过验证的灭菌工艺进行有效的控制、监测和相关文档资料，来代替对最终灭菌产品进行无菌检查的无菌评价放行程序128实行参数放行的意义灭菌工艺验证的自然结果克服成品无菌检查的统计学局限性和不精确结果减少质量控制成本缩短生产周期，降低库存压力128参数放行的实践要求参数放行须得到政府部门的批准严格控制和监测灭菌前产品中的微生物污染状况严格控制灭菌工艺须用指示剂监控每个灭菌批须有区分已灭菌和未灭菌产品的系统容器的密封完好性验证129129欧美国家的参数放行美国针对四种灭菌方式湿热灭菌、干热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐射灭菌130欧洲针对三种灭菌方式湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌130参数放行法的首选工艺湿热灭菌工艺是参数放行的首选工艺有效、简单微生物杀灭范围广研究透彻，可信赖度高易于控制和验证131131湿热灭菌工艺的参数放行流程控制列出灭菌工艺的操作步骤明确每一关键参数的一级和二级控制限度明确必须报警的运行参数及机械性能参数安装足够的辅助性传感/测量仪器给予主系统充分的保障保证所有的工艺参数监测器均处在经校验的合格状态下工作产品灭菌工艺验证之前应首先对灭菌釜进行彻底的（空载）性能确认分别在满载或部分装载状态下，验证灭菌设备的性能132132湿热灭菌工艺参数放行的关键工艺参数腔室温度（一级控制、二级控制，温度仪表）腔室压力（一级控制、二级控制，压力仪表）灭菌时间（一级控制为暴热时间，二级控制为各阶段的开始时间和相应时间间隔）灭菌工艺赋予产品的F0值评判标准：如果上述不合格关键参数超过一个，即使生物指示剂指示合格，该批应视为非无菌批。更不得以无菌检查结果来仲裁133133参数放行的基础–无菌保证系统无菌保证系统是实施参数放行的基础，是为保证产品无菌所采取的计划和活动的总和。对于最终灭菌产品，通过消除可能导致非无菌品产生的各种潜在风险，达到无菌保证的目的。134134无菌保证系统的要素135无菌保证系统产品设计原料和辅助系统灭菌前生产过程防止混淆产品密封完整性灭菌工艺全面质量管理体系1351365-2.风险管理136生产过程控制–基本原则基本原则生产按照经过验证的工艺进行防止微生物污染发生防止已灭菌品与未灭菌品发生混淆137137最终灭菌工艺产品的微生物污染控制点灭菌前微生物污染水平初始污染菌数及其耐热性灭菌釜冷却用水避免产品在灭菌工艺的冷却阶段中发生二次污染138138风险管理的生命周期139风险评估风险识别风险分析风险评价风险控制风险降低风险接受风险沟通沟通风险回顾回顾139批产品参数放行前应确认和检查的无菌保证相关项目产品完好性灭菌前产品和灭菌釜冷却介质的微生物污染水平灭菌指示剂的变化情况过滤器完好性试验测试数据灭菌釜已完成计划性预修和常规检查，所有非计划性维修均经无菌保证工程师和微生物专家审批所有仪器、仪表均经校准灭菌釜通过产品装载确认试验产品灌封数量、送往灭菌釜的数量、灭菌釜内数量、移出灭菌釜的数量、送往包装工序的数量和考虑放行的数量均处于平衡状态灭菌过程记录经相关人员审核放行140140参数放行的风险评估示例141141参数放行的风险评估示例142142参数放行程序示意图1431431445-3.耐热性测定与密封完整性验证144145单细胞微生物的死亡规律在死亡过程中活性细胞数量以相对恒定的速率下降使用物理或化学方法杀灭纯种单细胞微生物时，单位时间内死亡的微生物数量比例（如百分比）相对稳定145LgN=-U/DT+LgN0微生物死亡遵循半对数致死规律146半对数热致死模型(等效灭菌线）146

147D值的影响因素物理、化学条件、环境因素、湿度，如：孢子所处的介质、测试温度、内包装材料灭菌时间（由加热和冷却滞后所致的影响）加热和培养计数之间的温度、时间和环境条件用来培养计数灭菌后孢子的培养基等芽孢是否处于被包裹状态，此状态会使其耐热性大大增强微生物的耐热性（或统称对灭菌剂的耐受性）147148D值的影响因素-续影响微生物的耐热性因素还包括：在氯化钠或氯化钾存在条件下，G..嗜热脂肪杆菌的耐热性会增强；在二价钙离子和镁离子存在时，B.凝结芽孢杆菌的耐热性也会增强；在钾离子存在的情况下，C.梭状芽孢梭菌的耐热性会增强鳌合剂的存在（如柠檬酸）也会影响耐热性，强鳌合剂可以竞争性作用周围的离子，使包衣式芽孢的耐热性产生变化。在接种的载体上（例如纸或橡胶），也可观察到相似的耐热性差异。……148FractionNegativeMethod阴性分数法

-Spearman-KarberMethod史丕曼-卡伯法

-Stumbo,Murphy,andCochranMethod

DT值的确定方法149DirectEnumerationMethod直接计数法

又称SurvivalCurveMethod残存曲线法149D值测定仪器150Biological

Indicator—EvaluatorResistometer(简称BIER/Vessel)油浴装置–用于残存曲线法

150D值测定仪器的典型温度曲线151温度时间(分钟)151残存曲线法测定D值仪器及材料油浴（适宜的温度范围，精度，容量）毛细管与支架试验用芽孢悬浮液准备工作悬浮液占试验悬浮液比例不超过10%每0.05ml试验悬浮液中的芽孢为106-108确定试验参数数据分析线性回归和相关系数要求Y=mX+b，m=(Y∑X-∑XY)/(X∑X-∑X2)γ=mδX/δY152152实测数据153121.1±0.5℃下梭状芽孢杆菌孢子在PBS中的存活数量时间(min)存活数量(CFU)对数值01.02.03.04.05.01.7×105

3.1×104

5.0×103

1.3×103

4.0×102

4.0×101

5.244.493.703.112.61.60153D值计算154121.1±0.5oC下梭状芽孢杆菌孢子在PBS中的存活曲线1.根据曲线进行测量：任选两个对数值的整数值，找到相对应的灭菌时间用时间差除以对数差，得D值惯用法：测出一个对数单位的时间差如图示:3.1-1.7=1.4(分钟)2.利用EXCEL平台直接计算残存曲线斜率，再取负倒数D=-1/(-0.6989)=1.43(分钟)154Spearman-KarberMethod155T=Tk－d/2－(d/10×f)例：通过阴性分数法估算D值[每组中无微生物生长样品数（f）/每组样品数（n）]D=T/(log10N0+0.2507)155Stumbo-Murphy-CochranMethod156DT=u/Log10N0－Log10(2.303Log10n/q)n–样品总数

q–暴热处理后的阴性样品总数156Z值测定与计算测定某一微生物至少在三个温度点的D值每个温度点的D值至少单独测量三次,取其平均值(同温度下各D值间差异应小于10%);以D值对数值为纵坐标,温度点为横坐标,绘出Z值线(线性相关系数r2>0.9);该线的斜率的负倒数即为某微生物在特定介质内的Z值.157157产品密封完整性验证–目的与要求理论上讲，无菌检查有助于发现因密封性缺陷而产生大面积微生物污染的产品应证明产品经受挑战性灭菌（如最高F0值或二次灭菌）后，在其有效期内始终保持密封系统的完好性密封完好性的再验证158158产品密封完整性验证–微生物侵入试验示意图159培养基容器支架菌悬液容器/胶塞密封处159产品密封完整性验证–微生物侵入试验的要点（1）样品准备在生产线上将培养基灌装至产品容器，并在生产线上完成压塞、轧盖工序。经最高温度-F0值组合程序灭菌培养14天，确认无微生物生长确认培养基的灵敏度160160产品密封完整性验证–微生物侵入试验的要点（2）测试用微生物–铜绿假单胞菌ATCC9027测试后培养7天首次测试后，利用剩余样品每隔12个月重复挑战试验1次，直至有效期满。161161162主题6.参数放行实施展望参数放行的历史1981年美国首个药品参数放行申请递交。1985年1月，在正式的行业指南公布前，获得获批首次递交的申请被视为次后申请的标准模式1987年，FDA颁布法规CPG7132a.13直到上世纪90年代中期，才有其他公司获得参数放行的批准2010年2月，FDA参数放行申报指南2012年8月，FDA更新了CPG（达标指南）163目前支持参数放行的国家美国英国瑞士瑞典爱尔兰荷兰挪威西班牙新加坡澳大利亚比利时加拿大哥伦比亚捷克共和国丹麦德国匈牙利中国？164ICH参数放行引入ICH文件之中参数放行已达成国际性共识参数放行的基本条件强化微生物/工程学的监管教育背景：工程学和微生物学经验：有微生物学和灭菌工程设计的工作经验经湿热灭菌和无菌保证的专业培训有足够的能力，来监管无菌保证程序的开发、验证以及日常控制/监测，包括：验证计划和科学合理的手段产品的处置有微生物学及工程设计资质的人员参数放行程序的基本要素166无菌保证计划以可靠的质量系统为基础可靠的无菌保证计划由以下要素组成：对微生物和工程学的强化监管质量风险管理产品设计生产工艺的设计对环境和产品生物负荷的监测和控制将已灭菌与未灭菌产品隔离（装载监控）灭菌系统设计灭菌工艺开发和验证持续监测和控制变更控制风险评估的重点人员产品设计生产工艺设计环境，产品生物负荷的监测和控制已灭菌未灭菌品的隔离灭菌系统的设计灭菌工艺开发和确认/验证持续监测和控制变更控制工艺流程的风险评估168美国药典中的微生物学章节内容169Chart10b.Microbiology—SterileProducts〈55〉BIOLOGICALINDICATORS—RESISTANCEPERFORMANCETESTS〈63〉MYCOPLASMATESTS〈71〉STERILITYTESTS〈151〉PYROGENTEST〈1072〉DISINFECTANTSANDANTISEPTICS〈1112〉APPLICATIONOFWATERACTIVITYDETERMINATIONTONONSTERILE

PHARMACEUTICALPRODUCTS〈1113〉MICROBIALCHARACTERIZATION,IDENTIFICATION,ANDSTRAINTYPING〈1116〉MICROBIOLOGICALCONTROLANDMONITORINGOFASEPTICPROCESSINGENVIRONMENTS〈1117〉MICROBIOLOGICALBESTLABORATORYPRACTICES〈1207〉PACKAGEINTEGRITYEVAL