卵巢颗粒细胞凋亡课件

猪卵泡颗粒细胞凋亡的检测及影响因素

报告内容一引言二颗粒细胞凋亡的研究三颗粒细胞凋亡的生物学特征四颗粒细胞凋亡的检测五颗粒细胞凋亡的调节机制六颗粒细胞凋亡的影响因素七研究意义一引言哺乳动物卵泡闭锁十分普遍，只有少量卵泡发育成熟排卵，其余大部分卵泡都将闭锁退化。在卵泡由原始卵泡向初级卵泡、次级卵泡逐渐发育成排卵前成熟卵泡时，卵泡闭锁同时发生目前认为颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的主要原因,并先后在大鼠（1991）、猪（1998）、牛（1994）和绵羊（1995）等身上得到证实三颗粒细胞凋亡的生物学特征

正常颗粒细胞（图1）凋亡早期颗粒细胞中出现染色质凝缩，向核边缘聚集，核电子密度增大，核膜皱缩，但胞质中细胞器尚维持较正常状态（图2）凋亡中期染色质进一步高度凝集和边缘化，并靠近核膜，形成凋亡细胞常见的典型的半月结构。胞质中出现较多的空泡(图3)凋亡后期细胞碎裂后形成凋亡小体。它们是由部分高度凝集的染色质被质膜包裹所形成的一种凋亡细胞残体(图4)

四颗粒细胞凋亡的检测方法方法形态学生化流式细胞仪光学显微镜荧光显微镜透射电镜TUNEL

DNALadder

ELLSA

Annexin

光学显微镜观察HE染色法石蜡切片：取材→固定→上行梯度酒精脱水→二甲苯→透蜡→包埋→切片→贴片→染色颗粒细胞涂片：颗粒细胞悬液→预固定→涂片→风干→固定→染色方便，快速，成本低，是检测大量样本的较好选择荧光显微镜观察常用的DNA特异性染料有Hoechst33342，Hoechst33258，DAPI,这些染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发出明亮的蓝色荧光这种方法也方便快捷，可以在第一时间观察，也是检测大量样本的较好选择DNA末端原位标记(TUNEL)法

脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickend-lablelingTUNEL)原理：颗粒细胞凋亡时，染色体DNA双链或单链断裂而产生大量的3′-OH粘性末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素，过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3′-末端，从而进行凋亡细胞的检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3′-OH形成，很少被染色TUNEL可进行原位染色，能准确反映细胞凋亡的典型生化特征和形态学特征，可用于石蜡切片，冰冻切片，培养的细胞和组织分离的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用ELLSA法原理：细胞凋亡时,激活内源性核酸内切酶，它将双链DNA从各核小体间连接区裂断产生寡核苷酸小体，而核小体的DNA与核组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗能力，不被内源性核酸酶所断裂，故在细胞膜破裂前凋亡细胞的胞质内含有大量的寡核苷酸小体主要使用单克隆抗DNA抗体及抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白的存在与否，从而判定细胞是否发生了凋亡这种方法的优点在于可定量检测，敏感性高，不需要精密仪器，可用于各种物种的检测碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）是一种不能透过完整细胞膜的核酸染料，但在凋亡晚期或死细胞时期可透过细胞膜而使细胞核红染在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的变化，而此阶段PI不能通过细胞膜细胞坏死时，虽然也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，但此时细胞膜的通透性明显增加，PI等核酸染料进入细胞与细胞核中的核酸结合，发出红色荧光所以AnnexinV-常与PI合并使用，来区分凋亡早晚期细胞与死亡细胞，这种方法省时、可靠，是目前比较理想的检测细胞凋亡的方法流式细胞仪检测法原理:由于凋亡细胞形态上发生改变，细胞的光散射特性也随之而发生变化。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特征往往被认为是细胞凋亡的特征之一此外，细胞凋亡时由于染色体降解，核碎裂，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞的侧散射光常增加。因此可根据前散射光和侧散射光的变化检测凋亡细胞是一种既可定量也可定性的简便、快速、高灵敏度的检测方法，既可以检测细胞凋亡情况，又可以检测凋亡细胞所处周期五颗粒细胞凋亡调节机制

5.1Fas及FasL受体系统Fas(Apo-1或CD95)，I型跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子（TNF）和神经生长因子受体（NGF）家族的细胞表面分子，是FasL的受体FasL，II型跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子（TNF）家族的细胞表面分子。FasL与Fas作用是一条重要的凋亡途径凋亡途径：FasL与Fas结合后，Fas三聚化使DD构象改变，结合接头蛋白FADD，激活caspase-8，启动caspase的级联反应，降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡Fas与fasL受体凋亡途径研究表明，Fas与FasL存在与人、大鼠、小鼠、牛和猪的卵巢颗粒细胞中，且在闭锁卵泡中高表达，健康卵泡中也存在，但含量低，不引起颗粒细胞凋亡试验发现:Fas定位在胞浆，不是胞膜，以非活化状态存在，当FSH撤退、IGF-1或雌激素浓度改变时，启动凋亡信号，活化Fas，高表达，并向胞膜移位，与FasL结合5.3TRAIL和TRAIL受体系统TRAIL（TNF-relatedapoptosis-inducingligand

）是肿瘤坏死基因家族（TNF）成员，也属于典型的II型跨膜蛋白，与TNF家族的其他成员相比,TRAIL含有一个12～16个氨基酸特异序列插入形成的特殊的延长环,其结构和功能与Fas(APO-1)相似所以又称APO-2最近体外研究指出：TRAIL既能诱导细胞死亡又能诱导增殖凋亡途径：TRAIL-DR4或（DR5）-TRADD-FADD-easpase-8-caspase增殖途径：TRAIL-DR4或（DR5）-RIP-NF—ΚB5.5其它配体受体系统

体外培养研究表明：还有其他受体，如加压素Ⅱ型受体、促性腺激素释放激素受体等也可能调节了卵泡闭锁，但是在闭锁卵泡的选择中，这些受体在体内的生理学角色还没有定下来六影响颗粒细胞凋亡的因素

6.1激素类

6.1.1促性腺激素促性腺激素是一类能够激发性腺功能的激素垂体促性腺激素：促卵泡素(FSH)，促黄体素(LH)胎盘促性腺激素：孕马血清促性腺激素(PMSG)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)因此，人们提出促性腺激素可能抑制颗粒细胞凋亡的分子机制模型为:促性腺激素通过与颗粒细胞膜上的相应受体结合一方面刺激颗粒细胞合成并分泌IGF-1另一方面又激活了腺苷酸环化酶，从而产生大量的cAMPcAMP进一步激活蛋白激酶K信号通路，通过调节核内相关基因的表达，来实现抑制颗粒细胞凋亡6.1.2类固醇激素BilligH.等在动物体内研究证实,雌激素抑制卵泡颗粒细胞凋亡,促进卵泡发育分化；而雄激素则促进卵泡颗粒细胞凋亡切除性未成熟大鼠的垂体，连续补以外源雌激素两天，然后停止，往往会导致大量卵泡颗粒细胞凋亡如果在补以外源雌激素的同时给予外源雄激素，则会拮抗雌激素的作用使卵巢重量减轻，卵泡闭锁增加，颗粒细胞凋亡现象增多在检测闭锁卵泡和健康卵泡内的激素中发现，孕激素在闭锁卵泡中的量显著高于健康卵泡，但尚没有实验证实孕激素单独对颗粒细胞凋亡有何影响6.1.3活化素和抑制素

活化素(activin)和抑制素(inhibin)是性腺分泌的两种多肽类激素，可以调节垂体前叶分泌FSH的量Woodruff把人类重组抑制素注射到性未成熟大鼠卵巢中时可以明显增加中等直径卵泡的数量，而注射活化素则引起卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡Bicsak通过体内与体外的实验还发现促性腺激素可以促进颗粒细胞合成及分泌抑制素因此，可能抑制素也是一种辅助并提高促性腺激素促进卵泡生长的卵巢次生性因子

一氧化氮（NO）NO是由NO合成酶(NOS)催化精氨酸合成，NO参与了卵巢颗粒-黄体细胞和卵泡壁细胞类固醇激素的合成调节有实验表明NOS主要存在大鼠卵巢健康的未成熟卵泡的颗粒细胞中,然而在健康的成熟卵泡和即将闭锁卵泡的颗粒细胞中NOS是缺乏的未成熟卵泡是继续发育还是闭锁,与颗粒细胞中NOS表达水平的减少有关。在未成熟卵泡颗粒细胞中由NOS产生的NO可通过自分泌、旁分泌方式抑制颗粒细胞凋亡此外，还有一些细胞因子如TGF-β，IGF，IL-6，IL-1β等凋亡调控基因如：Bcl-2、Bax、bcl-xl、bcl-xs和p53神经酰胺，褐黑素，