DNA重组技术的基本工具概述

基因工程第一节：DNA重组技术的基本工具

浚县一中刘秀荣据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人

中国卫生部通报：2004年７月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%.能产生狂犬病抗体蛋白的转基因植物基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人类需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫DNA重组技术。基因工程的别名DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物或性状概念分析：问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？重组DNA导入形成基因工程培育抗虫棉的简要过程基因工程培育抗虫棉的关键步骤关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：形成重组DNA关键步骤三：重组DNA导入受体(棉花)细胞1.1DNA重组技术的基本工具关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：形成重组DNA关键步骤三：重组DNA导入受体(棉花)细胞“分子手术刀”——

限制性核酸内切酶“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——

基因进入受体细胞的载体“分子手术刀”——

限制性核酸内切酶⒈主要来源：2.种类与命名：3.作用：4.作用结果：主要是从原核生物中分离纯化出来的一类酶。约4000种识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键。形成粘性末端或平末端寻根问底底你能推测测限制酶酶存在于于原核生生物中的的作用是是是什么么吗？原核生物物易受自自然界外外源DNA的入侵，，但生物物在长期期的进化化过程中中形成了了一套完完善的防防御机制制，以防防止外来来病原物物的侵害害。限制制酶就是是细菌的的一种防防御性工工具，当当外源DNA侵入时，，会利用用限制酶酶将外源源DNA切割掉，，以保证证自身的的安全。。所以，，限制酶在在原核生生物中主主要起到到切割外外源DNA、使之失失效，从从而达到到保护自自身的目目的。goback现在已经经从约300种微生物物中分离离出约4000种限制性性内切酶酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷雷氏杆菌菌（Serratia大肠杆菌菌（EscherichiacoliR）练习：流流感嗜血血杆菌的的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分分离到3种限制酶酶，则分分别命名名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ限制酶的的识别序序列：能被限制制性内切切酶特异异性识别别的切割割部位都都具有回文序列列：在切割部部位，一一条链正向读的碱基基顺序与与另一条条链反向读的顺序序完全一致。限制性核核酸内切切酶作用用的是DNA分子中的的什么键键？磷酸二酯酯键即脱氧核核糖、磷磷酸之间间的连接接ATGGCATCTTCGAAGP

APAGGobackEcoRⅠ黏性末端端黏性末端端什么叫黏黏性末端端？被限制酶酶切开的的DNA两条单链链的切口口，带有有几个伸出的核核苷酸，它们之之间正好好互补配对对，这样的的切口叫叫黏性末端端。SmaⅠⅠ平末端平平末端限制酶DNA解旋酶区别限制酶与与DNA解旋酶的的区别切割特定定的核苷苷酸序列列的磷酸酸二酯键键将DNA两条链的的氢键打打开形成成两条单单链限制酶DNA水解酶区别限制酶与与DNA水解酶的的区别切割特定的核核苷酸序序列的磷磷酸二酯酯键，形成片片段的DNA.（双链））切割磷酸酸二酯键键，形成成单个的的脱氧核核苷酸。。目的基因因所在DNA片段载体DNA片段EcoRⅠEcoRⅠDNA连接酶1.作用:把切下来来的DNA片段拼接接成新的的DNA.2.作用原理理：催化磷酸二酯酯键形成3.种类：⑴E·coliDNA连接酶⑵T4DNA连接酶“分子缝合合针”——DNA连接酶可把黏性性末端之之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或或T4DNA连接酶即恢复被限限制酶切切开的两两个核苷苷酸之间间的磷酸酸二酯键键DNA连接酶与T4DNA连接酶酶还可把把DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链连接部位相同点双链单链在两DNA片段之间形将单个核苷酸酸加到已存在的核核酸片段的3’末端的羟基上，形成成磷酸二酯键都能形成磷酸酸二酯键二者都是蛋白白质类化合物物尝试写出下列列序列受EcoRI限制酶作用后后的黏性末端端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT“分子运输车”——基因进入受体体细胞的载体体1.作用：2.条件：3.种类：质粒、λ噬菌体的衍生生物和动植物物病毒等。将外源基因送送入受体细胞胞。⑴有1~多个限制酶切切点⑵对受体细胞胞无害⑶使导入基因因能在受体细胞胞中复制、表表达⑷有某些标记基基因，便于筛筛选⑶假如目的基基因导入受体体细胞后不能能复制或不能能转录，转基基因生物能有有预想的效果果吗？⑴作为分子运运输车——载体，如果没没有切割位点点将会怎样？？⑵霍乱菌的质质粒多个限制制酶切点，你你会用它来做做分子运输车车吗？⑷目的基因有有没有进入受受体细胞，如如何去发现？？作为载体的必必要条件:Goback质粒的特点：：是一种裸露的的、结构简单单、独立于细细菌拟核DNA分子外并能自我复制的小型双链环状DNA分子。能复制并带着着插入的目的的基因一起复复制有切割位点有标记基因的的存在，将来来可用含青霉霉素的培养基基鉴别。基因工程的工具限制酶主要存在于原原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶载体具备的条件质粒、λ噬菌体衍生物物、动植物病病毒种类能自我复制有一个或多个个酶切割位点点有标记基因对受体细胞无无害思考与探究P72、为什么限制酶酶不剪切细菌菌本身的DNA？通过长期的进进化，细菌中中含有某种限限制酶的细胞胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的的识别切割序列列；或者通过甲甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使使限制酶不能将将其切开。这样，尽管管细菌中含有有某种限制酶酶也不会使自自身的DNA被切断，并且且可以防止外外源DNA的入侵。3、天然的DNA分子可以直接接用做基因工工程载体吗？？为什么？提示：基因工程中作作为载体使用用的DNA分子很多都是是质粒（plasmid），即独立于于细菌拟核染染色体DNA之外的一种可可以自我复制制、双链闭环环的裸露的DNA分子。是否任何质粒粒都可以作为为基因工程载载体使用呢？？不是，作为基基因工程使用用的载体必需需满足以下条条件：思考与探究P71）载体DNA必需有一个或多个限限制酶的切割位点，，以便目的基基因可以插入入到载体上去去。这些供目目的基因插入入的限制酶的的切点所处的的位置，还必必须是在质粒本身需需要的基因片片段之外，这样才不至至于因目的基基因的插入而而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能能力，或整合到受受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复复制。3）载体DNA必需带有标记基因因，以便重组后后进行重组子子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体体细胞有害，，或不能进入入到除受体细细胞外的其他他生物细胞中中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和和在体外进行行操作，太大大就不便操作作。实际上自然存存在的质粒DNA分子并不完全全具备上述条条件，都要进进行人工改造造后才能用于于基因工程操操作。4、DNA连接酶有连接接单链DNA的本领吗？迄今为止，所所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于于原因，现在在还不清楚，，也许将来会会发现可以连连接单链DNA的酶。思考与探究P71)不属于质粒被被选为基因运运载体的理由由是A、能复制（（））B、有多个限制制酶切点C、具有标记基基因D、它是环状DNAD练习2）有关基因工工程的叙述中中，正确的是是（））A、所有的限制制酶只能识别别一种特定的的核苷酸序列B、质粒是基因因工程中唯一一的载体C、载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：：具具有有多个个限限制制酶酶切切点点，，以以便便与与目目的的基基因因连连接接D、DNA连接接酶酶使使黏黏性性末末端端的的碱碱基基之之间间形成成氢氢键键C练习习3）同同一一种种限限制制酶酶切切割割成成的的黏黏性性末末端端是是A.①②②B.①③③C.①④④D.②③③A（10江苏苏卷卷））4.下表表中中列列出出了了几几种种限限制制酶酶识识别别序序列列及及其其切切割割位位点点，，图图l、图图2中箭箭头头表表示示相相关关限限制制酶酶的的酶酶切切位位点点。。请请回回答答下下列列问问题题：：（1）一一个个图图1所示示的的质质粒粒分分子子经经SmaⅠⅠ切割割前前后后，，分分别别含含有有▲个游游离离的的磷磷酸酸基基团团。。（2）若若对对图图中中质质粒粒进进行行改改造造，，插插入入的的SmaⅠⅠ酶切切位位点点越越多多，，质质粒粒的的热热稳稳定定性性越越▲。（1）0、2（2）高高（3）用用图图中中的的质质粒粒和和外外源源DNA构建建重重组组质质粒粒，，不不能能使使用用SmaⅠⅠ切割割，，原原因因是是▲。（4）与与只只使使用用EcoRI相比比较较，，使