dna复制起始 谢贻冬课件

基因复制起始24复制起始模型建立复制起始的概念病毒原核生物：大肠杆菌真核生物复制起始在细胞周期的调控DNA复制的引发复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一富含AT的部位叫做复制起始点(originofreplication)常用ori或O表示。DNA复制起始☆原核生物染色体、病毒和核外DNA通常只有一个复制起点。☆真核生物染色体有多个复制起点，彼此相隔约3-10万bp。DNA复制起始至少需以下三个步骤:起始蛋白识别一个或一个以上的顺式作用元件DNA双链局部解旋

选择适宜位点进行引物合成及开始聚合反应二、原核生物的复制起始大肠杆菌的复制起点为oriC，由245个碱基对组成，这些序列在多数细菌中高度保守，关键序列是3个13bp和4个bpd的重复序列参与复制起始的9个蛋白和酶蛋白质亚基数目功能DnaA1识别起点序列，在起点特异性位置解开双链DnaB6解开DNA双链DnaC6帮助DnaB结合于起点HU2类组蛋白，DNA结合蛋白，促进起始引物合成酶（DnaG）1合成RNA引物单链结合蛋白（SSB）4结合DNA单链RNA聚合酶5促进DnaA活性DNA旋转酶（拓扑酶Ⅱ）4释放DNA解链过程中产生的曲张力Dam甲基化酶1使起点GATC序列的腺嘌呤甲基化复制起始的过程因为DNA聚合酶只能延长而不能开始新链合成，所以DnaB蛋白活化引物合成酶，先合成一小段以RNA为起始的引物（10-15bp），并最终被切除并由DNA取代。复制时，在原点通过解旋、解链和SSB蛋白结合等过程，这个复制点因形状象叉子，称复制叉。三、真核细胞的DNA复制起始复制器的选择：G1期A区主要由11bp的ARS共有序列(ACS)—5’(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)3’组成,为复制起始所必需.B区由2一3个部分重复的亚区(B1,B2等)组成，位于A区3’端,不具遗传保守性.复制起始位点的激活：S期起始识别复合物(ORC)以ATP依赖的方式特异识别ACS区和B1区并与之结合.复制起始位点的激活（S）Cdk和Dbf4磷酸化pre-RC，促使DNA解旋DNA聚合酶和辅助因子与复制起始位点的结合，并合成RNA引物装载滑动夹，聚合酶切换，开始合成前导链

后随链模板足够长时启动后随链的合成裂殖酵母的复制起始是完全不同于酿酒酵母裂殖酵母的复制起始有一个大小为500–1500bp的序列，是酿酒酵母的5–10倍。裂殖酵母起始区缺乏一个明显的共识序列，但它们包含两个或更多的重要序列，些非常重要的富含A-T的序列经常是不对称的，A在一条链，T在另一条链，这是ars3001，ars3002，和ars2004起始区基因缺失造成的。裂殖酵母的起始区也有ARS活动，使含一个起始区的质粒可在其中保持稳定并复制。裂殖酵母中有500–1000强弱不一的复制起始点，分布在三条染色体上。除了基本的ORC结合位点，裂殖酵母的起始区包含另一种重要位点，是SAP1蛋白结合位点。SAP1最初被确定为是一个蛋白被绑定到一个序列的交配型开关，在复制叉稳定性方面发挥重要的作用。SAP1结合在裂殖酵母ars3001一个重要区域，绑定到一个序列（A/T）4þN（C/g）（A/T）10–11（C/G）（A/T）4þN。像ORC一样，在起始区可能有多个亲和力不同的SAP1结合位点。复制起始在细胞周期的调控DNA复制起始在细胞周期中存在两个调控点M/G1过渡时建立复制前染色质状态G1/S过渡时参与复制起始的蛋白质因子接受周期依赖的调节,直接引发DNA合成.(复制起始复合体组装)复制前染色质状态相关因子：微小染色体维持基因家族MCM和CDC6、周期蛋白及其依赖的激酶。酵母体系中,M-S期核内的MCM5/CDC46作用于复制起始点,与ORC、ARS相互作用.CDC6的表达在M/G,期达到高峰,它在细胞周期的早期与ORC相互作用,提高起始点活性.哺乳类细胞中,在整个间期MCM基因产物都存在于核内,但它的G1期磷酸化水平与G2期明显不同.MCM突变株ARS活性降低,复制难以起始.在芽殖酵母中，ORC作为加载垫将Cdc6聚集在G1期的早期。然后，ORC和CDC6一起激活CDT1–MCM形成前复制复合体。MCM加载出现重复，意味着每个起始点都装上了几个MCM分子，作为复制叉出现损伤或障碍时的备份，以顺利完成复制。MCM加载到DNA不再需要ORC和CDC6辅助的辅助。在裂殖酵母，前复制复合体也需要ORC，Cdc18、CDT1、MCM和一个必不可少的额外蛋白SAP1。ORC和SAP1共同作用才能激活CDT1SAP1是一个新发现的复制起始蛋白直接参与前复制复合物组装，参与pre-RCs对Cdc18的加载。Cdt1和Cdc18加载到起始区后，这两种蛋白质共同负载MCM，与起始区结合完成前复制复合物的组装。DNA复制起始的引发酵母体系在生长因子等刺激下,G1期周期蛋白1、2和3活跃表达和积累，使细胞得以通过起始点（START）.起始点与S期间有两点联系:1、B型周期蛋白5和6依赖起始点的表达.它们可与周期蛋白依赖的激酶CDC28,CDK抑制因子P40形成复合物.2、该复合物被依赖起始点的P40降解激活.CDC28可使RP-A、CDC7等磷酸化.CDC7活化后在晚G1期磷酸化，调节ORC、MCM或其他蛋白质,激活DNA复制哺乳动物细胞内不止一种CDC(CDK)和周期蛋白参与这一过程G0期哺乳类细胞受生长因子刺激后,周期蛋白D出现早于周期蛋白E.周期蛋白D和它的mRNA不稳定.去除生长因子后,水平迅速下降.周期蛋白D可与CDK2、CDK4、CDK5结合,在细胞周期内发挥双向调节作用:a.刺激Gl期进行.b.确保DNA不提前复制.周期蛋白E的水平在G1/s过渡期最高.周期蛋白E可以结合并磷酸化修饰CDK2,作用于复制起始因子,诱导细胞进入S期.期蛋白E-CDKZ可使视网膜母细胞瘤敏