质粒DNA的提取纯化与鉴定课件

质粒DNA的提取、纯化与鉴定南通大学江苏省神经再生重点实验室蒋茂荣质粒DNA的提取、纯化与鉴定南通大学江苏省神经再生重点实验室1

一、基因克隆的质粒载体1、定义双链闭环DNA；1kb--200kb；独立存在于宿主染色体之外；具复制起始点；复制和转录不同程度依赖于宿主基因；编码某些酶，使宿主具有特殊标志，可供选择。一、基因克隆的质粒载体1、定义22、载体性质（1）.复制能力；（2）.容纳外源DNA的能力；（3）.选择标记：抗生素耐受。

（4）.引入多克隆位点；（5）.引入重组选择标记。2、载体性质33、载体分类：按功能分1.克隆载体2.表达载体

按宿主性质1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬菌粒、λ噬菌体、噬菌体M13等2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、昆虫杆状病毒3.穿梭载体3、载体分类：4质粒DNA的提取纯化与鉴定课件5质粒DNA的提取纯化与鉴定课件6质粒DNA的提取纯化与鉴定课件7质粒DNA的提取纯化与鉴定课件8质粒DNA的提取纯化与鉴定课件9二、质粒DNA的分离纯化

（一）、细菌培养物的生长和收获（二）、质粒DNA的提取1、碱裂解法小量制备质粒DNA:a、细菌的收集；b、加入100цl溶液Ⅰ，重悬细菌；c、加入200цl溶液Ⅱ，使细菌悬液清亮；d、加入150цl溶液Ⅲ，冰上放置3-5分钟；

二、质粒DNA的分离纯化

（一）、细菌培养物的生长和收获10

e、加入450цl酚：氯仿混匀；f、12000rpm，离心5分钟；g、吸取上清，加入2倍体积无水乙醇，室温静置2分钟；h、12000rpm离心5分钟，弃上清；i、75%乙醇洗涤，室温晾干；j、溶于适量TE/R中。e、加入450цl酚：氯仿混匀；11三、质粒DNA的鉴定（一）、紫外光谱分析通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。（二）、EB荧光分析（三）、电泳鉴定在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNAMarker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。三、质粒DNA的鉴定（一）、紫外光谱分析12质粒DNA的提取纯化与鉴定课件13质粒DNA的提取纯化与鉴定课件14质粒的电泳图谱质粒的电泳图谱15质粒DNA的提取、纯化与鉴定南通大学江苏省神经再生重点实验室蒋茂荣质粒DNA的提取、纯化与鉴定南通大学江苏省神经再生重点实验室16

一、基因克隆的质粒载体1、定义双链闭环DNA；1kb--200kb；独立存在于宿主染色体之外；具复制起始点；复制和转录不同程度依赖于宿主基因；编码某些酶，使宿主具有特殊标志，可供选择。一、基因克隆的质粒载体1、定义172、载体性质（1）.复制能力；（2）.容纳外源DNA的能力；（3）.选择标记：抗生素耐受。

（4）.引入多克隆位点；（5）.引入重组选择标记。2、载体性质183、载体分类：按功能分1.克隆载体2.表达载体

按宿主性质1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬菌粒、λ噬菌体、噬菌体M13等2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、昆虫杆状病毒3.穿梭载体3、载体分类：19质粒DNA的提取纯化与鉴定课件20质粒DNA的提取纯化与鉴定课件21质粒DNA的提取纯化与鉴定课件22质粒DNA的提取纯化与鉴定课件23质粒DNA的提取纯化与鉴定课件24二、质粒DNA的分离纯化

（一）、细菌培养物的生长和收获（二）、质粒DNA的提取1、碱裂解法小量制备质粒DNA:a、细菌的收集；b、加入100цl溶液Ⅰ，重悬细菌；c、加入200цl溶液Ⅱ，使细菌悬液清亮；d、加入150цl溶液Ⅲ，冰上放置3-5分钟；

二、质粒DNA的分离纯化

（一）、细菌培养物的生长和收获25

e、加入450цl酚：氯仿混匀；f、12000rpm，离心5分钟；g、吸取上清，加入2倍体积无水乙醇，室温静置2分钟；h、12000rpm离心5分钟，弃上清；i、75%乙醇洗涤，室温晾干；j、溶于适量TE/R中。e、加入450цl酚：氯仿混匀；26三、质粒DNA的鉴定（一）、紫外光谱分析通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。（二）、EB荧光分析（三）、电泳鉴定在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DN