犬骨髓CD34细胞种植人工血管置换后短时间内皮化的实验研究

犬骨髓CD34+细胞种植人工血管置换后短时

间内皮化的实验研究于振海张曙光李光新王坤阮长乐【摘要】目的：探讨骨髓CD34+细胞种植于经常使用膨体聚四氟乙烯(expandedpolyterafluoroethylene,ePTFE)人工血管和涤纶人工血管后二者的内皮化程度。方式：选杂种犬8条，依支架覆膜不同分为ePTFE组和涤纶组，每组实验犬2条，对照犬2条。实验犬采自体骨髓，提取CD34+细胞种植覆膜支架，对照犬采纳单纯自体血预凝覆膜支架。将人工血管植入犬的下腔静脉和腹主动脉。在术后第10、30天观看植入的人工血管通畅情形，采纳免疫组织化学方式鉴定内膜细胞来源，在光镜和电镜下观看人工血管新生内膜表面内皮化情形。结果：术后第10天实验组与对照组不同无统计学意义；术后第30天腔面新生内膜内皮细胞自人工血管吻合口向中间慢慢减少(P<)；而对照组内膜表面第10、30天均无内皮细胞覆盖。结论:经纯化的CD34+细胞种植于ePTFE和涤纶人工血管,均取得理想的内皮化。【关键词】人工血管-CD34•血管内膜[ABSTRACT]Objective:ToinvestigatetheendothelializationofartificialbloodvesselseededbyCD34+stemcells.Methods：Eightcrossbreddogswererandomizedintotwogroups.ArtificialbloodvesselcoveredwithePTFEorDacronwereimplantedintotheabdominalaortaartery(AAA)andinferiorvenacava(IVC).Ineachgroup,twodogswereimplantedbyprosthesesseededbyCD34+stemcells,twodogswereimplantedbyautogenousbloodonlyasprostheseswereexplantedattenorthirtyandelectronmicroscopywereapplyedtoexamineendothelializationofprostheses.CD34factorstainwereusedtoidentifyendothelialcells.Result:Confluentendothelialcellsappearedontheneointimaofseededwerenoendothelialcellsintheno-implatedprostheses.Conclusion:RapidendothelializationcanbeachievedintheprosthesescoveredwithePTFEorDacronwhichareimplantedbyCD34+stemeffectofDacron,sendodermisimplantedbyCD34+stemcellsisbetterthanePTFE*s.[KEYWORDS]Bloodvesselprosthesis*CD34*Tunicaintima人工血管作为一种非生物材料，其近远期通畅率是血管外科医师最关切的问题。资料统计人工血管重建膝下动脉的5年通畅率仅为%[1]o有研究说明以提纯的骨髓CD34+细胞种植人工血管具有较高的特异性，能够明显提高人工血管新生内膜的质量和数量，幸免了新生内膜钙化灶的形成，大大改善了患者的远期预后［2］。国内己有学者从骨髓和脐血中取得内皮细胞祖细胞,经体外诱导成内皮细胞，短时间培育扩增后用于人工血管内皮化的研究［3］0本研究以骨髓CD34+细胞种植目前临床经常使用的两种小口径（6mm）人工血管一膨体聚四氟乙烯（expandedpolytetrafluoroethylene,ePTFE）和涤纶人工血管，替代实验犬的腹主动脉和下腔静脉，观看短时间内腔面内皮细胞覆盖情形，为寻求一种具有抗血栓和抑制新生内膜增生的半生物化人工血管提供实验依据。1材料与方式实验动物济南地域杂种犬8条，雌雄不限,体质量（土）kg,犬龄1〜2岁。随机分为ePTFE组和涤纶组，每组4条，包括实验犬2条和对照犬2条。CD34+细胞的分离戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔麻醉,无菌条件下穿刺犬骼后上崎，成功抽取骨髓15〜20mL,置入肝素预处置的无菌试管内。PBS稀释后以Ficoll提取单个核细胞，调整细胞浓度2X107mL-loPE标记抗犬CD34单克隆抗体（购自BD生物，批号：BD550427）与CD34+磁珠结合，移入免疫磁珠分离系统（德国美天旋公司生产，型号：BD557812）,获取CD34+细胞，送流式细胞仪鉴定，4℃冰箱留宿手术备用。人工血管预凝取长3cm、外径6mm的ePTFE和涤纶人工血管各2条。于前肢抽取犬静脉血8mL,分离血浆。每只人工血管加mL血浆与mL%氯化钙溶液，两头夹闭轻轻旋转混匀5min预凝血管。开放一端，倾出混合液。实验犬用人工血管内再注入分离的mLCD34+细胞与对倍1mL自体血浆、％氯化钙的混合液，以2r/min速度缓慢旋转20min,倾出混合液。对照犬用人工血管不做此处置。所有人工血管均移至加有PBS的无菌培育皿中，置于冰上手术备用。人工血管植入犬戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上。无贱条件下打开腹腔，解剖后腹膜，暴露并分离肾下腹主动脉段3〜5cm,近、远端置橡胶牵引带。肝素（mg/kg）静脉推注，无损伤血管钳阻断腹主动脉近、远端，中间离断，间置入ePTFE（或涤纶）血管，以5-0prolene缝线两点法行端端吻合后开通血管,观看吻合口处有无漏血、腹主动脉搏动是不是良好。分离同一水平段下腔静脉。一样方式间置入ePTFE（或涤纶）血管。术中静脉给予液体500mL,青霉素80万U。术后天天青霉素80万U肌肉注射，持续3d；阿司匹林300mg随水饮，持续1周。天天观看犬手术肢体皮色、皮温、运动情形，股动脉搏动情形，后肢及腹壁静脉充盈情形。人工血管检测别离于术后第10和第30天处置两组实验犬和对照犬各1条。麻醉方式同前,显露移植的人工血管，观看外形和通畅情形。切取人工血管及相连的部份自体血管管壁,迅速肝素化后纵向剪开，观看管腔有无狭小、腔面是不是滑腻、有无血栓附着和新内膜覆盖情形。留取标本行HE染色、免疫组织化学及电镜检测。2结果CD34+细胞的鉴定锥虫蓝染色，流式细胞仪鉴定，由骨髓分离取得的CD34+细胞，活细胞数量为（土）X107mL-1（图1）。手术及术后情形术中吻合口对合良好，无渗血，动脉可触及明显搏动，静脉充盈中意，术后2h犬可正常站立。组织标本的大体观所有植入的人工血管均无明显的外压变形，与周围组织粘连较紧密。纵行剖开腔面，术后第10天取材的人工血管内部份腔面覆盖新内膜，且距吻合口越近新内膜越完整，流入道吻合口较流出道吻合口处完整，管腔内未见血栓附着，血管腔面滑腻,吻合口无组织增生。实验犬与对照犬无明显不同。术后第30天实验组的人工血管内腔面完全覆盖新内膜,表面滑腻,呈半透明状,未见血栓附着，管腔无狭小（图2）。光镜观看光镜下可见第30天两组实验犬动脉人工血管的新生内膜组织细胞排列有序，其腔面为扁平的内皮细胞层，混有少量纤维素和血细胞混合物，内皮细胞层外为纤维母细胞、胶原和滑腻肌细胞等。涤纶血管新生内膜贴附腔面紧密且完整，ePTFE血管新生内膜与血管腔而间有部份分离（图3）。免疫组织化学检测两组实验犬和对照犬的人工血管均行CD34抗原染色，第30天实验犬血管内膜见内皮细胞层呈棕黄色染色（图4）。扫描电镜观看第10天的实验犬人工血管电镜扫描可见：内皮细胞自吻合口向人工血管爬行，内皮细胞密度慢慢减少，其间见纤维蛋白和少量血细胞附着，部份区域可见散在散布呈梭形及正向梭形演变的内皮细胞。第30天ePTFE组实验犬人工血管电镜扫描示：吻合口处显现大量新生内皮细胞，沿血管轴向排列；细胞密度向人工血管中段慢慢减少,部份区域可见片状散布的内皮细胞（图5）。第30天两组对照犬人工血管内膜表面无内皮细胞覆盖，仅见血小板沉积形成的血栓及纤维组织排列。3讨论人工血管的诞生为血管外科的进展提供了必要的条件，己普遍应用于全身各个部位。目前大中口径人工血管替代人体大中动脉己获成功，但对血管内径＜6mm或血流速度较低的小动静脉,人工血管替代一直未能取得中意的成效[4],常常由于血栓形成和新生内膜增厚致使人工血管闭塞而使移植失败。最近几年来，小血管重建仍多采纳自体血管移植。但是，由于自体可供搜集的血管数量有限，且需考虑患者自身缘故，因此研制一种优良的小口径血管替代品就显得尤其重要。人工血管第一要考虑制造材料的生物相容性和生物稳固性。目前应用最多的人工血管材料有天然真丝、涤纶和ePTFE,其中ePTFE的利用率最高。但是临床资料显示，自体血管移植物2年后的通畅率可达75%,而ePTFE人工血管移植物的仅为30%［51978年Herring等［6］第一报导了内皮细胞种植技术,开辟了人造血管内皮化的新途径。Zilla等［7］用同源的血清成团培植出内皮细胞，使内皮细胞种植人工血管取得较普遍研究。Noishiki等［8］将犬自体骨髓移植于ePTFE人工血管置换腹主动脉，发觉其内膜增生在必然程度上减轻。Bhattacharya等［2］以为提纯的骨髓CD34+细胞种植人工血管比以骨髓种植的人工血管具有较高的特异性。Bhattacharya等将骨髓CD34+细胞种植到聚乙烯管(Polyethylenetute,PET)材料的人匚血管上,内皮化面积明显大于未种植人工血管］(92%±%)vs(%±%)］o大多学者以为CD34+细胞是造血干细胞和内皮祖细胞的一起先人细胞。在体外必然的条件下，内皮祖细胞能被诱导而分化、增殖、迁移并形成血管。正常人CD34+细胞在骨髓低密度单个核细胞中约占%(1%〜3%),在脐带血中为%一%,外周血中含量约为骨髓的1/10,因此骨髓和脐血是提取CD34+细胞的理想来源。近几年国内己开展了从骨髓和脐血中取得内皮细胞祖细胞、经体外诱导成内皮细胞、短时间培育扩增后用于人工血管内皮化的研究［3］。多项研究显示，CD34+细胞在种植人工血管进行人工血管内皮化方面已显现出庞大的潜能，有望取代成人血管种子细胞而成为最理想的组织工程血管细胞［9-10L本研究发觉骨髓CD34+细胞种植的涤纶和ePTFE人工血管都可快速的内皮化。实验犬第10天即可见内皮细胞自吻合口向人工血管爬行，第30天腔面新生内膜细胞密度从人工血管自吻合口向中间方向慢慢减少；而对照犬内膜表面无内皮细胞覆盖。免疫组织化学结果和电镜微观结构观看均证明为内皮细胞。涤纶人工血管CD34+细胞种植后贴附腔面程度和内皮化成效优于ePTFE人工血管，考虑涤纶人工血管本身孔隙较大，自体血管中的内皮细胞可能透过孔隙进入腔面，而对照犬那么无明显的内皮细胞覆盖，提示CD34+细胞种植人工血管能较好的内皮化，为临床长期应用提供了实验支持。【参考文献】MoriE,KomoriK,KumeM,etal.Comparisonofthelong-termresultsbetweensurgicalandconservativetreatmentinpatientswithintermittentclaudication[J].Surgery,2002,131:S269.BhattacharyaV,McsweeneypA,ShiQ,etal.Enhancedendothelializationandmicrovesselforma-tioninpolyestergraftsseededwithCD34+bonemarrowcells[J].Blood,2000,95(2):581-585.[3]张鸿坤，张楠，汪忠镐，等.CD34+干细胞的分化及其在人工血管内皮化中的应用[J].浙江大学学报,2004,33(2):147-150.VoeworkD,GuentherrevasculorizationofoccludedIliacarterieswithuseofself-expandableendoprotheses^J].Radiology,1990,175:411.[5]罗新锦，吴倩玉.小口径人工血管的研究进展[J].中国胸心外科临床杂志，2001,8：193-196.HerringM,GardnerA,GloverJ.Asigle-stagedtechniqueforseeingvasculargraftswithautogenousendothelium[J].Surgery,1978,84:498-504.ZillaP,PreissP,DeutschM,etal.Invitro-linedendothelium:initialintegrityandultrastructuralevents[J].Surgery,1994,116(