血样DNA的提取课件

实验目的学习高质量血样DNA的提取，理解DNAVortex等的使用实验原理应用物理、化学等方法从病人血样中提取较纯的全基因组DNA静置后的血液血细胞种类红细胞白细胞血小板数量特征最多最少1．成熟红细胞无核，两面凹的圆饼状。功能2．含血红蛋白，红色。1．体积比红细胞大。2．有核，种类繁多。1．体积最小，

无核。血细胞特征比较适中促进止血，加速凝血防御保护运输氧气和部分二氧化碳血浆主要成分结论血样各种成分中，只有白细胞含有DNA。化学试剂溶血液:9ml

作用：溶解红细胞、白细胞、血小板白细胞核悬浮液：2ml

作用：使白细胞核充分悬浮（悬浮主要靠物理方法：vortex）白细胞核裂解液：2ml

作用：裂解白细胞核，使DNA释放实验操作血样→加溶血液→离心→加核悬浮液→加核裂解液（立即震荡可过夜）→加蛋白沉淀液（立即震荡20s)→离心→留上清，加入异丙醇→离心→留沉淀，加70%乙醇→加TE→测OD注意事项能否提到高质量的DNA，好的血样是首要前提，故采集的血样应置于冰箱保存，并尽早进行DNA提取；做好标记：15ml离心管、1.5mlEP管均需首先进行标号；移液管使用前必须消毒，减少污染；移液管顶部要塞上棉花，防止反应液吸入移液枪内；注意事项从冰箱中取出血样时，要小心、不宜晃动，否则容易导致弃去血浆时，损失白细胞；补加溶血液时，应加至离心管12ml，即加入的溶血液体积应是原血样的3倍左右；

溶血5min后，在灯下看管内有无血块→If有，可进行二次溶血；实验操作离心机：4000rpm5min4℃，使白细胞核沉淀，弃去细胞碎片等大部分杂质步骤二：细胞碎片、白细胞核离心沉淀：白细胞核、少量杂质（血红素、RNA、蛋白）注意事项离心前注意配平，一则保护离心机，二则使离心效果更佳→If沉淀不紧密，可置于冰上5min,再离心一次。离心后，沉淀是白细胞核团，离心管倒扣于吸水纸的时间不宜太长，也不宜反复倒残余液，否则易导致白细胞核团损失。血红素

注：血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶活性，对DNA的后续应用造成影响，必须尽量除尽RNA由于RNA基本上存在于细胞质中，因而细胞膜破裂后，存在于上层液体中，离心后大多数已经除去。实验操作步骤三：沉淀：（白细胞核、少量杂质）细胞核悬浮于溶液中白细胞核悬浮液

悬浮液：(Tris-HCl：50mM、PH=8.0,NaCl：150mM（=生理盐水：0.9%?）,EDTANa2：20mM)

白细胞核的悬浮主要是vortex的功劳，因而要立即并充分vortex实验操作步骤五：DNA、大量蛋白、其他杂质蛋白沉淀液溶解状态的DNA、絮状蛋白沉淀、RNA沉淀离心，取上清DNA、盐类、微量RNA

、蛋白蛋白沉淀液：（CH3COONH4：7.5M）

离心：4500rpm15min4℃

注意事项细胞核的裂解是关键，因此必须保证充分的裂解时间，可过夜，至少一小时。加入白细胞核裂解液和蛋白沉淀液时，均应立即Vortex,使反应充分。Vortex：5档位置，20s，使白细胞核裂解液或蛋白沉淀液与样品充分混匀并反应。注意事项离心机：4500rad/min10min4℃，使洗涤后的DNA沉淀，从而洗去大部分盐离子

加入的异丙醇的量一般为DNA溶液体积的0.6-1倍加异丙醇和乙醇时，混匀方式应柔和，否则易导致DNA断裂，故不宜使用vortex。倒完乙醇后，为使离心管内的残余液尽量倒干，可将其倒扣在吸水纸上，从而减少乙醇挥发时间。实验操作步骤七：1×TE贮存

→

OD值检测（测浓度）、电泳检测（测完整性）

1:1*TE:（Tris-HCl：10mM、PH=8.0,EDTANa2：5mM

）

2:OD值检测:A260/280:>1.8RNA污染；

=1.8

DNA提纯效果好；

（一般在1.8-2.0，即满足条件）

<1.8

Pr污染。A260/230:≥2.0DNA提纯效果较好；

<2.0存在盐离子、多肽、碳水化合物等污染。

电泳检测：0.8%的琼脂糖、20ngDNA(对照：废血DNA）

实验注意事项若同时检测多个所提DNA的OD值时，由于操作时间长，微量样品易挥发，故宜在冰上操作。电泳检测结果检测结果显示：五个样品的条带基本处于同一位置，且都位于10kb的上方＝>所提取的DNA完整性较好。讨论1、DNA储存条件：短期（2-3天）→4℃；长期（两周以上）→-80℃2、血样-80度长久保存（如：1年以上），细胞较难裂解，应如何处理？

答：提前一晚放到4度即可；为了速融，可置于37度水浴一会。3、跑电泳后主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减，说明DNA出现降解，原因？解决方案？

答：1，匀浆操作不对；2，样品不新鲜和冷冻保存不好实验总结通过上网查询实验原理以及董洁老师、