微生物检验细菌形态学检查法

第十章细菌形态学检查法本章考点：1.显微镜普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜电子显微镜不染色细菌标本检查法细菌染色标本检查法常用染料常用染色方法细菌的形态学检查包括不染色标本检查法和染色标本检查法，显微镜是观察细菌形态所必备的基本工具。镜检不仅可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，而且根据细菌形态、结构和染色性有助于对病意义。一、显微镜在细菌的形态学检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种：即0.25μm0.2m10000.25μm0.25mm，肉眼便可以看清，一般细菌大于0.25μm，故用普通光学显微镜均能清楚看到。多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。1/8本法主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。。达数万至数十万倍，能分辨lnm。电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。前者适于观察细菌内部的超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件的观察。二、不染色细菌标本的检查细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。果更好撞击细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。检查厌氧菌的动力要用毛细管法进行检查。除细菌标本外，螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。三、细菌染色标本的检查细菌染色标本在普通光学显微镜下可以观察细菌的形态、大小、排列、染色性、特殊结构（膜、鞭毛）、异染颗粒等。美蓝、结晶紫、碱性复红等染色细菌。（一）常用染料pH2～5间，在碱性、中性、弱酸性的环境中细菌均带负电荷，易与带正电荷的染料结合而着色。常用的染料有碱性复红、结晶紫、美蓝等。酸性染料：电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。一般情况下细菌都带有负电荷故不易着色。如果降低菌液的pH使细菌带正电荷，则可被染色。细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）色常用于某些特殊的染色技术中。（二）常用的染色方法细菌染色的基本程序：涂片（干燥）→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）。。法和抗酸染色法。数标本在分离培养之前都要进行革兰染色、镜检。2/8意义：①鉴别细菌：通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。甚至有时结合细菌特殊形态结构及排列方式，对病原菌可进行初步鉴定。②选择药物参考：G+菌与G-菌对一些抗生素表现出不同的敏感性。③与致病性有关：大多G+G-菌大多能产生内毒素，两种致病作用不同。只针对性用于结核病、麻风病等的细菌检查。疑似结核分枝杆菌感染的标本，经抗酸染色后以油镜检查，即可作出初步鉴定。若查见红色抗酸杆菌，可报告为“找到抗酸分枝杆菌”。对临床疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。如痰标本涂片、固定，用0（0-罗丹明B）染色，以荧光显微镜检查，在暗背景中可观察到呈金黄色荧光的菌球。除以上所述染色方法外，用于细菌鉴定的还有鞭毛染色、异染颗粒染色等。本章练习题：用于观察细菌超微结构的显微镜是A.普通光学显微镜BC.相差显微镜D.荧光显微镜E.电子显微镜[答疑编号5]『正确答案』EA.形态BCE.排列方式[答疑编号5]『正确答案』BA.玻片法BCD[答疑编号5]『正确答案』CE第十二章细菌的培养与分离技术本章考点：1.基本条件3/8细菌实验室无菌实验室基本设备和器具2.细菌的接种与分离技术平板划线分离法斜面接种法液体接种法穿刺接种法倾注平板法涂布接种法3需氧培养法二氧化碳培养法厌氧培养法4分离培养基上菌落的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象5.细菌L标本采集培养方法生长现象，对初步识别细菌的属性很重要。一、基本条件（一）细菌实验室成。所以细菌室应该符合一定的条件。细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l行灭菌处理。细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。4/8操作。内的无菌状态。通风方式。无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、C0培养箱、厌氧培养设备；2用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。二、细菌的接种与分离技术接种分离法 用途接种分离法 用途连续划线分离法 主要用于杂菌不多的标本平板划线分离法分区划线分离法 适用于杂菌量较多的标本斜面接种法 要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特液体接种（避免气溶胶的产生） 多用于一些液体生化试验管的接种穿刺接种法 此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。倾注平板法 测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。三、细菌培养的方法碳培养法和厌氧培养法。（一）需氧培养法和液体培养基等，置于35℃温箱中孵育18～24h，一般细菌可于培养基上生长，但有些难以生长的细菌需培养更长的时间才能生长。另外，有的细菌最适生长温度是28℃～30℃，如鼠疫耶尔森菌，甚至在4℃也能生长，如李斯特菌。（二）二氧化碳培养法有些细菌初次分离培养时须置5%～l0%C02菌等。常以下列方法供给C02。C02C02从钢瓶通过5/8培养箱的C0，运送管进入培养箱内，调节好所需CO浓度自动控制后，将接种好的培养基直接放入培养箱2 2中培养即可。此法适于大型实验室应用。子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C0含量约占5%～l035℃温箱内培养。2培养时间一般为18～24h，少数菌种需培养3～7天或更长。化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0.4g和浓盐酸0.35ml种好的培养基都放入干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成C02（三）厌氧培养法适用于专性厌氧菌和兼性厌氧菌的培养。常用的厌氧培养法有：①疱肉培养基法；②焦性没食子酸法；③厌氧罐法；④气袋法；⑤厌氧手套箱法。四、细菌的生长现象（一）分离培养基上菌落的生长现象1.观察菌落：菌落的各种特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和粘度等。根据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为三型：光滑型）菌落粗糙型）菌落粘液型）2.血琼脂上的溶血α溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状；红细胞外形完整无缺。β溶血：又称完全溶血，红细胞的溶解在菌落周围形成一个完全清晰透明的环。γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。如产气荚膜梭菌。如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦气味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）线菌（泥土味）等。色素脂溶性色素：使菌落本身出现颜色改变。如金黄色葡萄球菌的金黄色色素。水溶性色素：使菌落周围的培养基出现颜色变化。如铜绿假单胞菌的铜绿色色素。（二）细菌在液体培养基中的生长现象浑浊生长：大多数细菌。沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力，有鞭毛的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性。无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。五、细菌L型的检查细菌L表现为形态多形性、染色不确定性、可滤过性、渗透压敏感性，生化反应减弱特性以及对β-内酰胺类和其他作用细胞壁抗生素的抵抗性。6/820液，以保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。如增菌肉汤出现轻度混浊或沉淀，再分离接种于L型选择平板或血平板。培养方法1～7L37℃7L型菌在LL颗粒型菌落，涂片染色为多形性。必要时需经传代返祖后进一步鉴定菌种。（2）型平板有菌落生长，可报告检出细菌L型；②血平板中菌落细型平板中有L型菌落，报告检出L型；③血平板及LLL验以供临床用药参考。本章练习题：A.菌丝BCD[答疑编号5]『正确答案』B分区划线分离法C.半固体培养基接种法D.液体培养基接种法E.倾注平板法5]『正确答案』A可用于观察细菌动力的接种方法是[答疑编号5]『正确