损伤修复与诱变育种

关于损伤修复与诱变育种第一页，共八十页，2022年，8月28日2直接修复：光复活修复，转甲基酶，插入酶碱基错配修复：甲基化引导的错配修复系统切除修复：UvrABC,Ap切除修复，糖基化酶切除修复GO系统重组修复:

同源重组SOS修复链交联的修复链断裂的修复第四节DNA损伤的修复机制第二页，共八十页，2022年，8月28日3第五节突变过程与诱变育种技术回复突变与抑制突变诱发突变的过程诱变育种的主要流程诱变育种中需要注意的几个问题第三页，共八十页，2022年，8月28日4一回复突变与抑制突变表型回复为野生型，可能是真正的回复突变（backmutation)

产生的，也可能是发生了抑制突变造成的。抑制突变（

suppressormutation）抵消或抑制了前一次突变的表型效应第四页，共八十页，2022年，8月28日5区分回复突变与抑制突变的方法第五页，共八十页，2022年，8月28日6抑制突变的特点如下：(1)抑制突变是在第一次突变不同位点将它抵消的。因此原来的突变可以通过野生型和回复突变型之间的杂交又恢复为突变型；

(2)抑制突变可能发生相同的基因中，抑制原来的突变，称基因内抑制，或发生在不同的基因中称基因间抑制。

(3)不同的抑制突变其作用方式不同。如有的抑制是在转录和翻译水平，有的可能是通过细胞生理功能来实现。第六页，共八十页，2022年，8月28日71基因内抑制第七页，共八十页，2022年，8月28日8LeuBS286MLeuB3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶,作用于亮氨酸生物合成的第二步LeuBS286L第八页，共八十页，2022年，8月28日9LeuBS286VLeuBS286LL308P第九页，共八十页，2022年，8月28日10第十页，共八十页，2022年，8月28日11野生型蛋白X轴切面电势分布S286V沿X轴切面电势分布S286L沿X轴切面电势分布S286LL308PS286LS286S第十一页，共八十页，2022年，8月28日12假定某一基因突变使一种蛋白质变为容易为另一物质所抑制，因而使野生型表型不能出现，再假定另一基因发生突变后这抑制物不再产生，那么后一突变基因便是前一突变基因的抑制基因。假定某一突变基因使某一代谢产物不能形成，再假定另一突变基因使同一代谢产物由另一途径合成，那么它也是前一突变基因的抑制基因。如果某一代谢中间产物具有某种表型效应，假定第一个突变基因中断了这一中间产物以后的代谢途径而使中间产物积累，再假定另一突变基因使中间产物出现以前的代谢途径中断，那么它也成为前一突变基因的抑制基因。2基因间抑制——代谢补偿第十二页，共八十页，2022年，8月28日13例1粗糙脉孢菌的腺嘌呤缺陷型(ade)突变35203产生一种由腺核苷酸合成的代谢中间产物转变来的紫色色素。在这一基因不发生回复突变的情况下，另外三个腺嘌呤缺陷型27663、28610、44411中的任何一个都抑制紫色色素的产生而恢复了野生型的不产色素这一性状。对于突变型35203的产生紫色色素这一性状来讲,突变基因27663、28610、44411都是它的抑制基因。第十三页，共八十页，2022年，8月28日14例2精氨酸的渗漏突变是嘧啶缺陷的抑制突变第十四页，共八十页，2022年，8月28日152基因间抑制——校正tRNA突变抑制基因（suppressor）或称校正基因

无义抑制（nonsensesuppressor）

错义抑制

(missensesuppressor)tRNA反密码子的突变tRNA其它结构的改变第十五页，共八十页，2022年，8月28日16第十六页，共八十页，2022年，8月28日17第十七页，共八十页，2022年，8月28日18氨基酰tRNA合成酶对tRNA和氨基酸两者具有专一性，它对氨基酸的识别特异性很高，而对tRNA识别的特异性较低。按照一般原理，酶和底物的正确结合是由二者相嵌的几何形状所决定的，只有适合的氨基酸和适合的tRNA进入合成酶的相应位点，才能合成正确的氨酰基tRNA。现已经知道合成酶与L形tRNA的内侧面结合，结合点包括接近臂，DHU臂和反密码子臂。第十八页，共八十页，2022年，8月28日19无义抑制第十九页，共八十页，2022年，8月28日20第二十页，共八十页，2022年，8月28日21错义抑制第二十一页，共八十页，2022年，8月28日22tRNA基因造成的抑制突变的特点:1.不是所有抑制基因都能产生有功能的蛋白质，关键是要看氨基酸取代的情况。

2.校正的作用不可能是完全的。①校正的tRNA分子是有限的而且还要和释放因子竞争；②若是错义抑制的话，由于氨基酸发生取代,使得蛋白质的活性有所降低。

3.每种抑制tRNA一般都只识别UAG终止密码子，而不再识别原来相应的密码子。第二十二页，共八十页，2022年，8月28日234.赭石突变抑制基因不仅可以识别赭石密码子（UUA），也可以抑制琥珀（Am）密码子UAG。但反过来Am抑制基因（CUA）就不能抑制赭石突变（UAA），这是由于摆动缘故所造成。5.当细胞中含有多个tRNA拷贝时，抑制才能发挥作用。6.有的抑制基因，不仅可以识别终止密码子，而且还可以识别原来的密码子。如野生型tRNATrp的反密码子是CCA，它可以识别原来的密码子UGG，而且还可以识别终止密码子UGA。第二十三页，共八十页，2022年，8月28日247.校正基因一般不会影响正常的终止(1)校正基因识别的终止密码子不一定和正常终止的密码子相同。有时正常终止位点有两个连续的终止密码子，而且结构不同，如UAG-UAA；(2)释放因子将和抑制基因竞争和终止密码子的结合；(3)抑制基因的效率很低，通常为1~5%，所以常不会抑制正常终止。第二十四页，共八十页，2022年，8月28日25二诱发突变的生物学过程第一阶段诱变剂接触DNA分子之前

进入细胞－－细胞表面屏障作用穿过细胞质，失活或增加活性细胞的生理状态（复制转录态）第二阶段从前突变到突变

DNA分子上的损伤，突变产生（经历细胞内对损伤DNA的修复，抑制基因作用）第三阶段基因突变到突变表型

表型迟延（phenotypiclag)生理性迟延和遗传性迟延第二十五页，共八十页，2022年，8月28日26Phenotypiclag表型迟延分离性迟延（Segregationallag）

对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，而突变通常发生在一个核上，包含突变的变异细胞必须经过多代细胞分离后，由杂和状态变为纯和状态，才有可能表现突变表型。生理性迟延Physiologicallag

变异细胞变为纯和状态后，在杂和期由正常基因所形成的蛋白（酶）仍然发挥作用，必须经过多代细胞分离后，才能将这些非变异的蛋白（酶）稀释掉，最终表现出突变的表型。第二十六页，共八十页，2022年，8月28日27诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。三诱变育种第二十七页，共八十页，2022年，8月28日28诱变育种

诱变

+筛选

诱变是随机的；筛选是定向的目前发酵工业生产菌株都是经过突变改造过的。第二十八页，共八十页，2022年，8月28日29诱变育种的基本过程—小概率事件第二十九页，共八十页，2022年，8月28日30诱变育种的基本过程选择合适的出发菌株↓制备待处理的菌悬液↓诱变处理↓筛选↓保藏和扩大试验第三十页，共八十页，2022年，8月28日31诱变剂选择诱变剂量选择平板筛选技术第三十一页，共八十页，2022年，8月28日321出发菌株的选择

出发菌株：用来进行育种处理的起始菌株◆出发菌株应具备

①对诱变剂的敏感性高；

②具有特定生产性状的能力或潜力；

◆出发菌株的来源

①自然界直接分离到的野生型菌株：

②历经生产考验的菌株：

③已历经多次育种处理的菌株：第三十二页，共八十页，2022年，8月28日33制备单细胞或单孢子悬液

要求①菌体处于对数生长期，孢子初萌发

②细胞分散且为单细胞，

方法①玻璃珠打散10-15min;

②加吐温80或Tritonx-100

③用无菌脱脂棉过滤。

制备：物理诱变剂——生理盐水，磷酸缓冲液

化学诱变剂——特定的缓冲液

浓度：细菌、放线菌＞108个/ml

霉菌、酵母菌＞106个/ml第三十三页，共八十页，2022年，8月28日342诱变剂

诱变剂的选择诱变剂作用的普遍性：

选择那些在其它菌种选育中诱变效果好的诱变剂。如：UV，亚硝基胍（NTG），快中子等。

诱变剂的特异性：

经验性：

如，四环素族抗生素用亚硝酸、羟胺，

青霉素用氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍．第三十四页，共八十页，2022年，8月28日35菌株的差异：（即使是同一菌）

A：遗传性不稳定的菌株---用缓和诱变剂

B：遗传性稳定的菌株---首用强，后用缓。

考虑诱变机制：

UV嘧啶，

亚硝酸

嘌呤，因此复合作用为好

第三十五页，共八十页，2022年，8月28日36诱变剂剂量的选择用90-99%杀菌剂量用50—85%的杀菌剂量，此时正突变率高，特别是出发菌株已是高产菌株。

第三十六页，共八十页，2022年，8月28日37第三十七页，共八十页，2022年，8月28日38诱变剂的处理方法

诱变剂使用方式：

单一处理，

复合处理：

诱变处理条件：温度（生长温度）

PH（缓冲剂），处理时间

诱变作用的终止：用解毒剂（终止缓冲液）、用水稀释

第三十八页，共八十页，2022年，8月28日39第三十九页，共八十页，2022年，8月28日40诱变剂使用方法举例------紫外线第四十页，共八十页，2022年，8月28日41亚硝酸---缓冲液

终止液第四十一页，共八十页，2022年，8月28日42甲基磺酸乙酯（EMS）------母液，工作液，终止液（解毒液）第四十二页，共八十页，2022年，8月28日43复合诱变处理（示例）-------固体诱变第四十三页，共八十页，2022年，8月28日443突变株的筛选

中间培养基因型+

环境

表型

目的：克服表型迟延，使突变充分表达分离性迟延现象生理性迟延现象

第四十四页，共八十页，2022年，8月28日45合适的筛选方法：

平皿快速检测法（初筛）变色圈法

透明圈法

生长圈法抑菌圈法

梯度平板法

摇瓶培养法（复筛）第四十五页，共八十页，2022年，8月28日46第四十六页，共八十页，2022年，8月28日47显色圈第四十七页，共八十页，2022年，8月28日48透明圈第四十八页，共八十页，2022年，8月28日49抑菌圈第四十九页，共八十页，2022年，8月28日50抑菌圈第五十页，共八十页，2022年，8月28日51生长圈第五十一页，共八十页，2022年，8月28日52第一轮：

一个出发菌株→→→

选出200个菌株→→→

选出50株→→→选出5株诱变处理初筛

（每株1瓶）复筛（每株3-5瓶）

第二轮：

5个出发菌株→→→

→→

→

选出50株

→→

→选出5株40株40株40株40株40株诱变处理初筛复筛（每株1瓶）（每株3-5瓶）复筛第五十二页，共八十页，2022年，8月28日53三类常见突变株的筛选产量突变株筛选

抗药性突变株的筛选（梯度平板法）营养缺陷型(auxotroph)的筛选

第五十三页，共八十页，2022年，8月28日54

产量突变株筛选琼脂块培养法（春日霉素）孢子悬液------诱变----适当培养（表型迟延）-----

涂布平板----打孔取菌落-----琼脂块培养----4-5天—

测定琼脂块所含的抗生素的抑菌圈----效价高菌

第五十四页，共八十页，2022年，8月28日55第五十五页，共八十页，2022年，8月28日56

高产菌株的初筛（抑菌圈法）。指示菌：黑曲霉As3.324；培养时间72小时。A为出发菌株。第五十六页，共八十页，2022年，8月28日57

抗药性突变株的筛选（梯度平板法）

第五十七页，共八十页，2022年，8月28日58ATCC25922在0.03125ug/ml的恩诺沙星制备的坡面平板上的菌苔、菌落第五十八页，共八十页，2022年，8月28日59第五十九页，共八十页，2022年，8月28日60营养缺陷型(auxotroph)的筛选MM基本培养基SM补充培养基CM完全培养基营养缺陷型－＋＋野生型＋＋＋原养型＋＋＋第六十页，共八十页，2022年，8月28日61基本培养基（minimalmedium,MM）－

MinimumEssentialMediumMM

：—凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。完全培养基（completemedium,CM）＋—满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。

补充培养基（supplemental

medium,SM）X

—在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。

第六十一页，共八十页，2022年，8月28日62筛选步骤

野生型菌株

C-1：诱变处理

C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）

C-3：检出缺陷型

C-4：鉴定缺陷型第六十二页，共八十页，2022年，8月28日63C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）

诱变后，仍存在大量的野生型，不利于分离（1）抗生素法野生型菌株在MM上生长+青霉素—杀死Ｇ＋

缺陷型菌株在MM上不生长＋青霉素—-不杀死注意：使环境的渗透压提高，避免细胞破裂。抗生素处理完后，离心收集细胞，并转入低渗溶液制霉菌素法则适合于真菌（例如：酵母、霉菌），可与真菌细胞膜上的麦角甾醇作用，从而引起溶菌第六十三页，共八十页，2022年，8月28日64第六十四页，共八十页，2022年，8月28日65（2）菌丝过滤法

适于：丝状（放线菌、霉菌）原理：野生型基本培养基上发育成菌丝；缺陷型孢子不萌发可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。

第六十五页，共八十页，2022年，8月28日66第六十六页，共八十页，2022年，8月28日67检出缺陷型逐个检出法影印检出法夹层培养法限量补给法第六十七页，共八十页，2022年，8月28日68逐个检出法

（牙签）第六十八页，共八十页，2022年，8月28日69影印检出法

第六十九页，共八十页，2022年，8月28日70夹层培养法

第七十页，共八十页，2022年，8月28日71限量补给法在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培养,筛选氨基酸缺陷型

大菌落为野生型，小菌落的为缺陷型。第七十一页，共八十页，2022年，8月28日72鉴定缺陷型生长谱法组合营养物法组合补充培养基法第七十二页，共八十页，2022年，8月28日73生长谱法

斜面菌种-----生理盐水洗下细胞------洗涤-----涂布（105个/皿）方法简便；回变和污染不影响结果测定物质可为粉末或纸片第七十三页，共八十页，2022年，8月28日74纸片1:氨基酸混合液;纸片2:维生素混合液;纸片3:核酸水解液;纸片4:酵母水解液

测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的