大鼠中枢ghrelin和GHS-R的分布及其促胃肠动力作用,人体生理学论文

大鼠中枢ghrelin和GHS-R的分布及其促胃肠动力作用,人体生理学论文Ghrelin是生长激素促分泌素受体(growthhor-monesecretagoguereceptor，GHS-R)的内源性配体，主要由胃黏膜组织中的泌酸细胞分泌。Ghrelin的生物学作用特别广泛，可促进生长激素分泌;调节摄食和能量代谢;刺激胃动力和胃酸分泌;调节心血管功能等。新近研究发现，ghrelin与消化道运动关系密切，外周和中枢给予ghrelin可加速胃排空，改善术后肠梗阻，促进胃和十二指肠消化间期复合肌电活动。Gong等用蛋白印迹方式方法和聚合酶链反响(polymerasechainreaction，PCR)技术发现GHS-R在大鼠的下丘脑有表示出;Gnanapavan等用PCR技术证实，ghrelin和GHS-R在人的胃、小肠、结肠、胰腺、胆囊、肺脏、垂体、卵巢、血管等处均有表示出;Dass和Xu等利用荧光免疫组织化学方式方法在人、大鼠和豚鼠的胃和结肠也发现了ghrelin及其受体。然而，关于ghrelin和GHS-R在中枢的组织细胞学分布及表示出量的比拟尚未见报道。除此之外，由于新鲜脑组织比拟难以断定各核团的精到准确界限，PCR及蛋白印迹技术只能分离出大鼠的部分脑区(如海马和下丘脑)，不能分离出华而不实包括的微小核团和亚核团，并进行表示出量比拟。因而，作者采用免疫组织化学和图像分析方式方法观察大鼠中枢ghrelin和GHS-R的分布，重点分析比拟二者在与消化功能相关脑区的表示出，为说明中枢给予ghrelin的促胃肠动力作用提供理论根据。1材料与方式方法1．1实验动物健康纯种Sprague-Dawley大鼠8只，雌雄不拘，体质量220～240g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。1．2主要试剂与仪器兔抗人GHS-R抗体购自美国SantaCruz公司，兔抗鼠ghrelin抗体购自美国凤凰生物制品有限公司，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(strept-avidin-biotincomplex，SABC)羊抗兔免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德公司，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，Q550CW型图像采集与分析系统购自德国Leica公司。1．3取材与标本制备实验大鼠用含100gL－1的水合氯醛400mgkg－1腹腔注射麻醉，经左心室穿刺至主动脉，用生理盐水快速冲血管，含40gL－1的多聚甲醛缓冲液经升主动脉灌注。取出大脑和小脑，切成厚4mm小块，40gL－1的多聚甲醛缓冲液固定8h，用含质量分数20%～30%的蔗糖溶液梯度脱水，液氮速冻后，组织包埋剂包埋，恒冷冰冻切片机切片。脑片行连续切片，厚15m。1．4免疫组织化学染色用SABC法进行ghrelin和GHS-R的免疫组织化学染色。详细步骤如下:冷冻切片用磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)浸泡5min，参加柠檬酸缓冲液(pH6．0)，微波修复，晾至室温，PBS冲洗3次，每次5min;体积分数3%的过氧化氢溶液(hydrogenperoxide，H2O2)浸泡30min，PBS冲洗3次，每次5min;体积分数0．5%的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)浸泡20min，PBS冲洗3次，每次5min。体积分数10%正常山羊血清封闭(37℃，30min)，甩去多余液体，切片分别滴加兔抗鼠ghrelin抗体(1:2500)和兔抗人GHS-R抗体(1:100)，4℃过夜，PBS冲洗3次，每次5min，滴加羊抗兔抗体(37℃，40min)，PBS冲洗3次，每次10min，滴加生物素化的辣根过氧化物酶复合物(avidin-biotinylatedhorseradishperoxidasecomplex，ABC)(37℃，20min)。PBS冲洗3次，每次10min，DAB显色，中性树胶封片，用图像分析系统观察ghre-lin和GHS-R阳性表示出。用PBS代替一抗做阴性对照，其余步骤不变。本实验选取与消化功能相关的核团进行重点观察，并分析了ghrelin和GHS-R阳性反响细胞在各核团不同分区的表示出。中枢阳性细胞计数:每只大鼠计数5张切片，每张切片在阳性细胞最密集处随机选取5个视野计数，取平均值作为该切片的阳性细胞数。对每只大鼠同一脑区的ghrelin和GHS-R阳性细胞记数时必须选择在一样平面。1．5统计学处理应用SPSS13．0统计软件进行数据分析，免疫反响阳性细胞数以均数标准差(x珋s)表示，多组间比拟采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2．1Ghrelin与GHS-R免疫阳性细胞的染色特征在大鼠中枢神经系统，ghrelin与GHS-R免疫阳性细胞广泛分布于多个脑区，二者的阳性表示出类似，阳性细胞为细胞膜和(或)细胞质有棕黄色颗粒沉着，细胞核无棕黄色颗粒沉着。二者的免疫强阳性反响在大脑皮质、下丘脑、丘脑室周核、海马(hippocamp，HIP)、杏仁核、小脑及脑干等部位均可见(图1、图2)。【图1-2略】2．2Ghrelin和GHS-R免疫阳性细胞在与消化道功能相关脑区的表示出在下丘脑区室旁核(periven-tricularnucleus，PVN)、弓状核(arcuatenucleus，ARC)、视前核(preopticnucleus，PON)、视上核(su-praopticnucleus，SON)、下丘脑外侧区(lateralhypo-thalamicarea，LH)、下丘脑腹内侧核(ventromedialhypothalamicnucleus，VMH)、下丘脑背内侧核(dor-somedialhypothalamicnucleus，DMH)、下丘脑背侧核(dorsalhypothalamicnucleus，DO)等处均可见ghre-lin及GHS-R阳性反响细胞。阳性细胞的细胞膜为棕黄色颗粒沉着，细胞核无棕黄色颗粒沉着。华而不实，ghrelin在PVN和LH阳性反响最强，免疫反响阳性细胞数分别为116．317．76和107．028．80，明显高于ARC(75．125．59)、DMH(56．847．07)和VMH(62．546．93)，差异有统计学意义(P＜0.05)(图1、图3);GHS-R在PVN和ARC阳性反响强，免疫反响阳性细胞数分别为111．0611．80和97．0610．37，明显高于LH(74．706．04)、DMH(58．657．28)和VMH(48．246．58)，差异有统计学意义(P＜0．05);阳性细胞染色深，数目多，细胞体呈圆形或椭圆形，多数细胞有粗短突起。其余核团阳性细胞数目较少，分布稀疏，染色呈淡黄色(图2、图3)。【图3】Ghrelin和GHS-R在HIP的CA1、CA2、CA3、CA4区的颗粒层均有分布，细胞多数呈椭圆形，细胞膜呈深棕色，细胞体较小，分布密集。华而不实，ghrelin在CA3区阳性反响最强，免疫反响阳性细胞数为123．2011．17，明显高于CA1(67．466．93)、CA2(37．915．21)、CA4(59．966．73)区，差异有统计学意义(P＜0．05)(图1、图4);GHS-R在CA3和CA4区均有强阳性反响，免疫反响阳性细胞数分别为103．799．23和86．487．25，明显高于CA1(51．166．56)、CA2(43．395．11)区，差异有统计学意义(P＜0．05)。锥体细胞层可见二者的强阳性反响(图2、图4)，细胞膜着深棕色，细胞体较大，呈圆形、椭圆形或锥形，突起粗短，着色明显，细胞质淡染。二者在分子层均未见着色。【图4】在杏仁核区，ghrelin和GHS-R阳性细胞细胞膜和(或)细胞质为棕色颗粒沉着，细胞核不着色。二者均在杏仁内侧核(medialamygdaloidnucleus，Me)呈强阳性反应，免疫反应阳性细胞数分别为140．229．07和115．667．35，明显高于杏仁基底内侧核(basomedialnucleusoftheamygdale，BM)(67．847．36)、杏仁基底外侧核前部(anteriordivi-sionofthebasolateralnucleusoftheamygdale，BLA)(33．464．24)、杏仁基底外侧核后部(posteriordi-visionofthebasolateralnucleusoftheamygdale，BLP)(43．066．24)、杏仁核(centralamygdaloidnu-cleus，CeA)(22．583．60)、杏仁外侧核(laterala-mygdaloidnucleus，LA)(31．955．77)，差异有统计学意义(P＜0．05)(图1、图2、图5)，细胞体多数呈椭圆形，细胞膜为深棕色，很多细胞有短粗突起。Ghrelin在BLA与BLP也有较多阳性细胞，细胞体较大，有短粗突起，形态以圆形居多，细胞膜染色呈淡棕色。GHS-R在BM有较多阳性细胞，细胞体较小，呈圆形或椭圆形，染色呈棕黄色。在CeA和LA，二者的阳性细胞数目较少，细胞体较小，染色呈淡黄色。2．3Ghrelin和GHS-R免疫阳性细胞在中枢其他部位的表示出在大脑皮层区，各层均有ghrelin与GHS-R阳性反响细胞。二者在分子层、外颗粒层、多形细胞层阳性反响均较弱，染色呈淡黄色，阳性细胞轮廓不清楚明晰，体积较小，形态以圆形和椭圆形居多，还可见梭形细胞。在内颗粒层和外锥体细胞层，ghrelin阳性反响较强，阳性细胞呈棕黄色，轮廓清楚明晰，形态呈圆形或椭圆形，无突起染色，细胞核不着色。GHS-R阳性表示出在外锥体细胞层较多，内颗粒层较弱。在内锥体细胞层，GHS-R和ghrelin阳性反响均较强(图1、图2)，细胞呈棕黄色，突起染色明显，细胞核不着色，形态多为锥形。【图5】在小脑蒲肯野细胞，ghrelin与GHS-R均呈强阳性反响(图1、图2)，细胞胞体大，呈梨形，细胞膜和细胞质着深棕色，突起无明显着色。二者阳性反响在小脑的分子层和颗粒层较弱，细胞小而圆，细胞膜和细胞质呈棕黄色。除此之外，在前庭神经上核、外侧核、中缝核、小细胞网状核和面神经核等处均可见ghrelin和GHS-R阳性细胞。在延髓，ghrelin与GHS-R均有强阳性反响(图1、图2)，细胞膜和细胞质呈深棕色，细胞体呈多形性，有明显突起。在孤束核、迷走神经背核、延髓网状核及最后区等处可以见ghrelin和GHS-R阳性细胞。3讨论新近研究发现，ghrelin与消化道运动关系密切，可促进摄食和胃排空，增加胃酸分泌，加速小肠转运，有效改善术后肠梗阻。近来的研究多关注于ghrelin的组织分布，已有研究发现，ghrelin在胃肠道和中枢神经系统均有分布，主要由胃黏膜内分泌细胞(主要为X/A样细胞)分泌，在小肠、肾脏、下丘脑、腺垂体、胰腺、甲状腺、心脏、卵巢及胎盘等处也有少量分泌，可通过内分泌或旁分泌形式作用于受体，在局部发挥作用。但对其受体GHS-R分布的研究并不充分。以往研究发现，GHS-R主要分布于垂体、下丘脑和胃，在心脏、肺、胰腺、肠、脂肪组织及肾也有分布，介入调节内分泌与能量代谢。当前，关于二者在中枢各脑区的组织学定位及微小核团和亚核团的表示出水平比拟尚未见报道。作者就此进行了进一步研究，并重点分析了二者在与消化功能密切相关脑区的表示出水平比拟。研究结果显示，GHS-R在大鼠中枢广泛存在，阳性细胞细胞核不着色，细胞膜着黄色或棕黄色，细胞质有少量着色，主要分布于大脑皮质、下丘脑、丘脑室周核、HIP、杏仁核、小脑及脑干等部位。以往研究用蛋白印迹法和PCR技术证实GHS-R在中枢和外周均有表示出，用荧光免疫组织化学方式方法在人、大鼠和豚鼠的胃和结肠肠神经丛也发现ghrelin及GHS-R。本研究结果与其结果相符，并在这里基础上进一步观察了二者在与消化功能密切相关脑区(包括核团及亚核团)的表示出。下丘脑位于间脑的腹侧部，构成第3脑室下部的底壁和侧壁。除介入神经内分泌、水电解质代谢和体温调节等功能的调整，下丘脑也是调节摄食和消化道运动的重要中枢。下丘脑从前向后分为3个区:视上部位于视穿插上方，由SON和PVN组成;结节部位于漏斗的后方;乳头部位于乳头体。下丘脑与其他脑区有复杂而广泛的纤维联络，它不仅接受来自大脑皮质、边缘系统、脑干的传入纤维，还发出大量的纤维到达大脑皮质、边缘系统、中脑、脑桥和延髓。下丘脑能通过3种途径对机体进行调节:(1)由下丘脑核发出的下行传导束到达脑干和脊髓的植物性神经中枢，再通过植物性神经调节内脏活动;(2)下丘脑的SON和PVN发出的纤维构成下丘脑-垂体束到达神经垂体，两核分泌的加压素(抗利尿激素)和催产素沿此束流到神经垂体内储存，在神经调节下释放入血液循环;(3)下丘脑可分泌多种多肽类神经激素对腺垂体的分泌起特异性刺激作用或抑制作用，称为释放激素或抑制释放激素。近来研究发现，ghrelin的促胃肠动力作用与下丘脑密切相关，下丘脑ARC可介入调节其促动力作用。以往研究证实，大鼠脑内存在ghrelin和GHS-R，主要分布于下丘脑，但并未研究其在下丘脑主要亚核团的表示出。本研究结果显示，ghrelin和GHS-R免疫阳性细胞在下丘脑PVN、ARC、LH、VMH、DMH等处均有分布。Ghrelin免疫阳性细胞在LH和PVN居多，GHS-R免疫阳性细胞在PVN和ARC居多。这提示在消化道运动的调节中，下丘脑发挥着重要作用，ghrelin可能通过PVN、ARC及LH发挥其生理学作用。HIP不仅与认知功能如学习、情感、记忆有关，也是调节内脏活动的重要中枢，它与下丘脑、杏仁核、延髓髓质有着极其复杂的互相联络，在调节哺乳动物的进食行为、饱感及胃肠运动中发挥着重要作用。HIP构造由HIP本部、齿状回、下托、束状回和灰被组成。它从室间孔处延至侧脑室下脚顶部，全形呈弓形。根据HIP本部的细胞构筑可再将其划分为4个亚区，分别命名为CA1、CA2、CA3及CA4区，CA4区与下托相连接。齿状回的皮质分为分子层、颗粒层和多形层。本实验研究结果显示，GHS-R免疫阳性细胞在HIP各区均有分布。HIP在解剖构造上属于边缘前脑皮质构造，边缘系统不是一个独立的解剖学和功能性实体，它是管理学习经历体验、整合新近与既往经历体验，同时启动和调节种种行为和情