免疫学及免疫学检验标记技术

标记免疫技术医学检验系临床微生物学及免疫学教研室二OO四年三月标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术标记免疫技术免疫测定技术免疫组化技术示踪物及标记技术放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术化学发光技术金免疫技术⋯⋯⋯第八章放射免疫技术

类型：放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、重复性好等标记物:常用的核素有两大类γ射线：131I、125I、57Cr和60Coβ射线：14C、3H和32P。使用最广泛的是：125I①性质活泼、易制备标记物②对被标记物的免疫活性影响小③测量方法简便、已推广④半衰期较长、核素丰度高标记方法125I的标记原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基及组胺残基上的氢原子方法：直接标记法

氯胺T法和乳过氧化物酶法间接标记法

联接标记法适用分子原理特点缺点直接标记肽类、蛋白质、酶存在酪氨酸、组胺残基等基团操作简便、易标记、比放射性高不适于活性功能区的残基标记间接标记甾类化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、组胺残基等基团,需添加可避免氧化／还原剂对被标记物活性的损伤等添加基团可能影响被标记物活性标记物纯化

对游离的125I等试剂与标记物进行分离方法：分子筛凝胶过滤；离子交换层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）；高效液相色谱（HPLC）标记物鉴定放射化学纯度

单位标记物中结合在被标记物上的放射性占总放射性的百分率。一般要求大于95％。免疫活性

标记过程中，被标记物活性损伤程度。B/T％>80％，B/T％↑抗原损伤↓。比放射性

单位化学量标记物中所含的放射性强度.常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。比放射性↑方法更灵敏；过高辐射自损伤大，对标记物免疫活性影响大，储存稳定性差。抗血清鉴定多克隆抗体的抗血清是放射免疫分析的主要试剂之一，其质量直接影响方法的特异性和灵敏度。亲合力选用亲和常数K值大(109~1012L//mol)抗血清特异性其程度可直接影响结果的准确性

滴度最大稀释度。在本技术方法中是指结合50％标记抗原时的抗血清的稀释度。放射免疫疫分析（RIA））基本原理理采用定量量的标记记抗原（（Ag＋）和非标标记抗原原（Ag）竞争争性结合合有限量量特异性性抗体（（Ab））的反应应。以未结合合的Ag*为F，Ag*Ab复合物物为B，，则B/F与Ag的量量变存在在着函数数关系。。B/F60(％)50403020

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0.81.62.43.24.04.85.6Ag(ng/ml)测定方法法与步骤骤1.抗原原抗体反反应：平平衡法或或非平衡衡法2.分离离结合与与游离标标记物沉淀剂沉沉淀复合合物，离离心分离离。如第第二抗体体沉淀法法、聚乙乙二醇沉沉淀法或或活性炭炭吸附法法等。要要求：分分离彻底底，迅速速；分离离试剂和和过程不不影响反反应平衡衡；操作作简便，，重复性性好且经经济。3.放射射性测定定及数据据处理晶体闪烁烁计数仪仪(γ射线)或或液体闪闪烁计数数仪(β射线)绘制标准准曲线，，计算待待检抗原原浓度。。免疫放射射分析（（IRMA）基本原理理单位点IRMA：利用用过量标标记抗体体与待测测抗原进进行反应应，形成成抗原抗抗体复合合物，反反应平衡衡后，用用固相抗抗原结合合反应液液中剩余余的未结结合标记记抗体并并将其分分离，测测定上清清液的放放射量。。双位点IRMA先用固相相抗体与与抗原反反应结合合,然后后再用过过量的标标记抗体体与已结结合于固固相抗原原的另一一抗原决决定簇结结合,形形成固相相抗体-抗原-标记抗抗体复合合物,洗洗弃反应应液中剩剩余的标标记抗体体,测定定固相上上的放射射性。IRMA与与RIA的的异异同同点点标记记物物在RIA中中核核素素标标记记抗抗原原，，抗抗原原有有不不同同种种类类，，根根据据其其化化学学结结构构，，标标记记时时需需用用不不同同的的核核素素和和不不同同的的方方法法。。在在IRMA中中核核素素标标记记抗抗体体。。抗抗体体为为蛋蛋白白质质，，有有利利于于碘碘化化标标记记，，不不同同抗抗体体标标记记方方法法基基本本相相同同。。标标记记抗抗体体的的比比活活度度高高，，提提高高了了分分析析的的灵灵敏敏度度。。反应应速速率率反应应速速度度与与反反应应物物的的浓浓度度呈呈正正比比，，在在IRMA中中标标记记抗抗体体是是过过量量的的，，而而且且不不存存在在竞竞争争性性结结合合复复杂杂的的反反应应，，所所以以反反应应速速度度较较RIA快快。。在在RIA中中抗抗体体量量是是微微量量的的，，所所以以一一定定要要用用高高亲亲和和力力的的多多克克隆隆抗抗体体，，而而在在IRMA中中应应用用亲亲和和力力较较低低的的单单克克隆隆体体也也能能得得到到满满意意的的结结果果。。反应应原原理理RIA为为竞竞争争抑抑制制，，测测得得放放射射性性的的量量与与受受检检抗抗原原呈呈反反比比。。IRMA为为非非竞竞争争结结合合，，剂剂量量反反应应曲曲线线为为正正相相关关的的直直线线关关系系。。特异异性性在双双位位点点IRMA中中，，一一般般均均应应用用针针对对不不同同位位点点的的单单克克隆隆抗抗体体，，其其交交叉叉反反应应率率低低于于应应用用多多克克隆隆抗抗体体的的RIA。。检测测范范围围通常常RIA的的工工作作范范围围为为2-3个个数数量量级级，，而而RIMA可可达达3个个数数量量级级以以上上。。分析析误误差差RIA中中加加入入的的抗抗体体和和标标记记抗抗原原都都是是定定量量的的，，加加样样误误差差可可严严重重影影响响测测定定结结果果。。IRMA中中标标记记和和固固相相抗抗体体在在反反应应中中都都是是过过量量的的，，只只有有受受检检标标本本的的加加样样误误差差才才会会影影响响分分析析结结果果。。因因此此，，IRMA的的批批内内和和批批间间变变异异均均比比较较小小。。其他他RIA可可以以测测定定大大分分子子量量与与小小分分子子量量的的物物质质，，双双位位点点IRMA只只能能测测定定在在分分子子上上具具有有2个个以以上上抗抗原原表表位位的的物物质质。。在在RIA中中应应用用的的为为多多克克隆隆抗抗体体，，亲亲和和力力和和特特异异性性要要求求较较高高，，但但用用量量很很少少。。IRMA中中标标记记抗抗体体和和固固相相抗抗体体用用量量较较多多，，一一般般均均用用来来源源丰丰富富、、特特异异性性较较高高的的单单克克隆隆抗抗体体。。放射射免免疫疫技技术术的的应应用用常用用于于各各种种激激素素、、微微量量蛋蛋白白、、肿肿瘤瘤标标志志物物和和药药物物等等微微量量物物质质的的测测定定。。问题题：：放放射射性性污污染染、、常常用用核核素素半半衰衰期期短短、、试试剂剂盒盒稳稳定定期期不不长长不不易易自自动动化化仪仪器器分分析析等等。。第九九章章免免疫疫荧荧光光技技术术免疫疫荧荧光光技技术术(immunofluorescencetechnique)是是标标记记免免疫疫技技术术中中发发展展最最早早的的一一种种。。是将将抗抗原原抗抗体体反反应应的的特特异异性性与与荧荧光光物物质质检检测测的的敏敏感感性性和和直直观观性性结结合合起起来来的的一一种种方方法法。。基本原理利用荧光素素标记抗体体，使之在在涂片上或或组织切片片上与标本本中的待检检抗原特异异结合，采采用高发光光效率的点点光源，透透过滤色板板发出一定定波长的光光，使结合合在标本上上的荧光素素被激发而而产生荧光光，借助荧荧光显微镜镜观察底物物片上荧光光染色形态态，来判断断有无待检检抗原或抗抗体。第一节荧荧光的基本本知识异硫氰酸荧荧光素（FITC））为黄色或橙橙黄色结晶晶粉末，分分子量为389.4，最大吸吸收光波长长为490-495nm，最最大发射光光波长520-530nm，，呈现明亮亮的黄绿色荧光光，是应用最最广泛的荧荧光素。主要优点：：①人眼对对黄绿色较较为敏感；；②通常切切片标本中中的绿色荧荧光少于红红色，降低背景干干扰。四乙基罗丹丹明（RB200））为橘红色粉粉末，不溶溶于水，易易溶于酒精精和丙酮。。性质稳定定，可长期期保存。最最大吸收光光波长为570nm，最大发发射光波长长为595－600nm，呈呈橘红色荧光光。常用于双双重标记或或对比染色色。四甲基异硫硫氰酸罗丹丹明（TRITC））最大吸引光光波长为550nm，最大发发射光波长长为620nm，呈呈橙红色荧光光。其异硫氰氰基可与蛋蛋白质结合合，但荧光光效率较低低。荧光分子的的辐射能力力在受到激激发光较长长时间的照照射后会减减弱甚至猝猝灭，一些些化合物对对荧光有猝猝灭作用，，因此荧光光物质的保保存应注意意避免光（（特别是紫紫外光）的的直接照射射和与其他他化合物的的接触。荧光抗体的的制备作为标记的的荧光素应应符合以下下要求：①应具有能能与蛋白质质分子形成成共价健的的化学基团团，与蛋白白质结合后后不易解离离，而未结结合的色素素及其降解解产物易于于清除。②荧光效率率高,与蛋蛋白质结合合后，仍能能保持较高高的荧光效效率。③荧光色泽泽与背景组组织的色泽泽对比鲜明明。④与蛋白质质结合后不不影响蛋白白质原有的的生化与免免疫性质，，与蛋白质质的结合物物稳定，易易于保存。。⑤标记方法法简单、安安全无毒。。荧光抗体是是将荧光素素（如FITC）与特异性性抗体以化化学方式共共价结合而而成。标记方法：：搅拌法(适合大样样品)透析法(适适合小样品品)标记抗体的的纯化：透透析法层析分离法法荧光抗体的的鉴定F/P比率：将制备的荧荧光抗体稀稀释至A280≈1.0，分别测读读A280（蛋白质特特异吸收峰峰）和标记记荧光素的的特异吸收收峰F/P值越高，说说明抗体分分子上结合合的荧光素素越多，反反之则越少少。一般用用于固定标标本的荧光光抗体以F/P＝1.5为宜，用于于活细胞染染色的以F/P＝2.4为宜。抗体效价：效价越大大标记抗体体的特异性性越高非特特异荧光越越少。效价价在1:16-1:32者较较为理想抗体特异性性：免疫电泳泳和交叉免免疫电泳观观察特异性性沉淀线或或沉淀峰，，在紫外线线照射下发发出强烈荧荧光第二节免免疫荧光光显微技术术基本原理：使荧光抗抗体与标本本切片中组组织或细胞胞表面的抗抗原进行反反应，洗涤涤除去游离离的荧光抗抗体后，于于荧光显微微镜下观察察，在黑暗暗背景上可可见明亮的的特异荧光光。直接法荧光抗体染染色直接法优点：操作作简便、特特异性高、、非特异荧荧光染色色因素少，，缺点：灵敏敏度偏低，，每检查一一种抗原需需制备相应应的特异荧荧光抗体间接法间接法优点：灵敏敏度高，在在不同抗原原的检测中中只需应用用一种荧光光抗体。既既可检测抗抗原，也可可检测抗体体。免疫荧光技技术在医学学检验中的的应用在细菌学检检验中主要要用于菌种种的鉴定。。免疫荧光用用于梅毒螺螺旋体抗体体的检测是是梅毒特异异性诊断常常用方法之之一。用荧光抗体体染色法可可检出病毒毒及其繁殖殖情况。在寄生虫感感染诊断中中，间接免免疫荧光试试验（IFAT）是是当前公认认的最有效效的检测疟疟疾抗体的的方法。免疫荧光法法还是检测测自身抗体体的好工具具，在自身身免疫病的的实验诊断断中应用广广泛。其突突出优点是是能以简单单方法同时时检测抗体体和与抗体体起特异反反应的组织织成分，并并能在同一一组织中同同时检查抗抗不同组织织成分的抗抗体。荧光抗体技技术的一种种特殊应用用是流式细细胞分析（（flowcytometry）。可可用于检测测细胞大小小、折散率率、粘滞度度等，更常常用于T细细胞亚群等等的检测。。第十章酶酶免疫技技术第一节酶酶免疫技术术概述基本原理利用酶催化化底物反应应的生物放放大作用,提高特异异性抗原-抗体免疫疫学反应的的检测敏感感性的一种种标记免疫疫技术。基本特点：：①标记后保保留酶和抗抗原(抗体体)的活性性②酶促反应应专一性，，保证特异异性③底物反应应放大作用用，提高敏敏感性④酶标试剂剂保存稳定定⑤操作简便便，安全易易行主要试剂的的制备与要要求一、酶与酶酶作用底物物（一）用于于标记酶的的要求：酶活性高标记后酶活活性稳定，，且不影响响标记抗原原与抗体的的免疫反应应性酶催化底物物后信号易易判定或测测定酶活性不受受样品中其其他成分的的影响酶、辅助因因子及底物物理化性质质稳定，安安全无害，，价廉（二）常用用酶及其底底物1.辣根过过氧化物酶酶（HRP）常用底物：：邻苯二胺（（OPD））：反应显显橙黄色，，应避光，，致癌性四甲基联苯苯胺（TMB）：反反应后呈蓝蓝色，无需需避光，无无致癌性，，但水溶性性差。2.碱性性磷酸酶（（AP）常用底物为为对硝基苯苯磷酸酯（（p-NPP），产产物为黄色色。*AP灵敏性性高与HRP，但不不易获得纯纯品，稳定定性及酶标标记物收率率低于HRP，且价高高，故应用用不如HRP普及。。二、酶标记记抗体或抗抗原基本要求：：酶标记抗原原纯度要高高，抗原性性完整；抗抗体的特异异性好，效效价高，亲亲和力强，，比活性高高以及易于于批量生产产和分离纯纯化酶标记方法法1.交联法法以双功能交交联剂为““桥”，分分别与酶和和抗体（抗抗原）连接接形成结合合物。如戊戊二醛交联联法。2.直接法用过碘酸钠钠活化酶蛋蛋白分子后后，再与抗抗体（抗原原）结合。。仅适用于于含糖蛋白白分子的酶酶（如HRP）标记记物制备。。三、固相载载体基本要求结合容量高高，结合稳稳定；可与与抗原抗体体复合物等等大分子蛋蛋白结合；；生物大分分子固化后后仍保持活活性；固化化方法简便便易行、快快捷经济。。固相载体的的种类与选选择1.塑料制品材料经济，，操作简便便，易于自自动化，最最常用。2.微颗粒结合容量大大，反应迅迅速，逐渐渐普遍用于于自动化分分析。3.膜载体硝酸纤维素素膜（NC）、尼龙龙膜等微孔孔滤膜，广广泛应用于于定性或半半定量的斑斑点ELISA。四、、免免疫疫吸吸附附剂剂原理理：：非非共共价价键键吸吸附附或或共共价价键键化化学学偶偶联联（（包包被被））。。一般般采采用用偏偏碱碱性性（（pH9.6））的的碳碳酸酸盐盐溶溶液液（（ELISA板板））。。封闭闭：：1％％－－5％％牛牛血血清清白白蛋蛋白白或或5％％－－20％％小小牛牛血血清清。。酶免免疫疫技技术术的的分分类类酶免免疫疫组组化化用于于检检测测组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片中中的的抗抗原原和和抗抗体体酶免免疫疫技技术术均均相相酶酶免免疫疫测测定定酶免免疫疫测测定定固固相相酶酶免免疫疫测测定定异相相酶酶免免疫疫测测定定（ELISA））液相相酶酶免免疫疫测测定定均相相酶酶免免疫疫测测定定Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E基本本原原理理：：利利用用酶酶标标抗抗体体结结合合抗抗原原形形成成复复合合物物后后，，标标记记酶酶的的活活性性发发生生改改变变的的原原理理，，在在不不将将复复合合物物与与游游离离酶酶标标抗抗体体分分离离的的情情况况下下，，直直接接测测定定系系统统中中总总的的标标记记酶酶活活性性的的改改变变，，进进而而推推算算出出待待检检样样品品中中的的抗抗原原量量。。异相相酶酶免免疫疫测测定定（enzymeimmunoassay,EIA））基本本原原理理：：在在抗抗原原抗抗体体反反应应后后，，先先将将抗抗原原抗抗体体复复合合物物与与游游离离的的酶酶标标抗抗体体分分离离，，再再测测定定酶酶标标记记的的复复合合物物催催化化底底物物显显色色的的活活性性，，最最后后推推算算出出样样品品中中抗抗原原的的含含量量。。液相相EIA：分分离离剂剂分分离离游游离离的的和和结结合合的的标标记记物物。。固相相EIA：固固相相载载体体结结合合酶酶标标复复合合物物，，经经洗洗涤涤去去除除游游离离的的酶酶标标抗抗体体。。如如ELISA。。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E第二二节节酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)基本本原原理理：：使抗抗原原或或抗抗体体结结合合到到某某种种固固相相载载体体表表面面，，并并保保持持其其免免疫疫活活性性在测测定定时时，，把把受受检检标标本本（（测测定定其其中中的的抗抗体体或或抗抗原原））和和酶酶标标抗抗原原或或抗抗体体按按不不同同的的步步骤骤与与固固相相载载体体表表面面的的抗抗原原或或抗抗体体起起反反应应用洗洗涤涤的的方方法法使使固固相相载载体体上上形形成成的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物与与其其他他物物质质分分开开，，最最后后结结合合在在固固相相载载体体上上的的酶酶量量与与标标本本中中受受检检物物质质的的量量成成一一定定的的比比例例。。加入酶反反应的底底物后，，底物被被酶催化化变为有有色产物物，产物物的量与与标本中中受检物物质的量量直接相相关，故故可根据据颜色反反应的深深浅进行行定性或或定量分分析ELISA技术术类型：：ELISA可用用于测定定抗原，，也可用用于测定定抗体，，在这种种测定方方法中有有3种必必要的试试剂：固相的抗抗原或抗抗体，酶标记的的抗原或或抗体，，酶作用的的底物。。1．双抗抗体夹心心法特点：非竞争结结合反应应常用于抗抗原的检检测适用于分分子中具具有至少少两个抗抗原决定定簇的多多价抗原原，而不不能用于于小分子子半抗原原的检测测所用两种种抗体分分别针对对同一个个抗原分分子的不不同抗原原决定簇簇2．间接接法3.竞争争法特点：用于抗原原和半抗抗原的定定量测定定，也可可对抗体体进行测测定。酶标Ag（Ab）与样样品或标标准品中中的非标标记Ag（Ab）具有有相同的的与固相相Ab(Ag)结合的的能力。。反应体系系中，固固相Ab（Ag）和酶酶标Ag（Ab）是固固定限量量的，且且前者的的结合位位点少于于酶标记记与非标标记Ag（Ab）的分分子数量量和。反应后，，结合与与固相载载体上复复合物中中被测定定的酶标标Ag（（Ab））的量（（酶活性性）与样样品中非非标记Ag（Ab）的的浓度成成反比。。4.捕获获法（反反向间接接法）主要用于于血清清中某种种抗体亚亚型成分分（如IgM））的测定定。基本原理理：固相抗IgM待检标本(IgM)抗原(与特异抗体结合)E酶标抗体底物第三节膜膜载体体的酶免免疫测定定固相膜免免疫测定定与ELISA相类似似,其特特点是以以微孔膜膜作为固固相.标标记物可可用酶和和各种有有色微粒粒子,如如彩色乳乳胶、胶胶体金等等。常用用固相膜膜为硝酸酸纤维素素膜。类型：免免疫渗滤滤试验：：穿流形形式免疫层析析试验：：横流形形式斑点酶免免疫吸附附试验（（dot-ELISA）免疫印迹迹法(Westernblot)免疫印迹迹法（immunoblottingtest，，IBT）亦被称为为Westernblot分三个阶阶段进行行:SDS-聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳（SDS）电转移酶免疫定定位SDS抗原等蛋蛋白样品品经SDS处理理后带阴阴电荷，，在聚丙丙烯胺凝凝胶中从从阴极向向阳泳动动，分子子量越小小，泳动动速度就就越快。。此阶段段分离效效果肉眼眼不可见见（只有有在染色色后才显显出电泳泳区带））电转移将在凝胶胶中已经经分离的的条带转转移至硝硝酸纤维维素膜上上，选用用低电压压（100V））和大电电流（1-2A），通通电45min转移即即可完成成。此分分阶段分分离的蛋蛋白质条条带肉眼眼仍不可可见。酶免疫定定位将印有蛋蛋白质条条带的硝硝酸纤维维素膜（（相当于于包被了了抗原的的固相载载体）依依次与特特异性抗抗体和酶酶标第二二抗体作作用后，，加入能能形成不不溶性显显色物的的酶反应应底物，，使区带带染色。。阳性反反应的条条带清晰晰可辨，，并可根根据SDA加入的的分子量量标准，，确定各各组分的的分子量量。第四节酶酶免免疫测定定的应用用病原体及及其抗体体广泛应应用于传传染病的的诊断。。病毒如如肝炎病病毒、风风疹病毒毒、疱疹疹病毒、、轮状病病毒等；；细菌如如链球菌菌、结核核分枝杆杆菌、幽幽门螺杆杆菌和布布氏杆菌菌等；寄寄生虫如如弓形体体、阿米米巴、疟疟原虫等等。蛋白质如如各种免免疫球蛋蛋白、补补体组分分、肿瘤瘤标志物物（例如如AFP、CEA、PSA））、多种种血浆蛋蛋白质、、同工酶酶、激素素（如HCG、、TSH）。非肽类激激素如T3、T4、雌雌激素、、皮质醇醇等。药物和毒毒品如地地高辛、、苯巴比比妥、庆庆大霉素素、吗啡啡等。ABC-ELISA(应用亲亲和素和和生物素素的ELISA)生物素-亲合素素系统(biotin-avidinsystem，BAS)，，是70年代后后期应用用于免疫疫学，并并得到迅迅速发展展的一种种新型生生物反应应放大系系统。由由于它具具有生物物素与亲亲合素之之间高度度亲和力力及多级级放大效效应，并并与荧光光素、酶酶、同位位素等免免疫标记记技术有有机地结结合，使使各种示示踪免疫疫分析的的特异性性和灵敏敏度进一一步提高高。亲和素素是一种种糖蛋蛋白，，可以以和4个生生物素素分子子亲密密结合合。现现在使使用更更多的的是从从链霉霉菌中中提取取的链链霉和和素（（strepavidin））。生物素素（biotin）。。卵黄黄、肝肝组织织提取取用化化学方方法制制成的的衍生生物，，生物物素－－羟基基琥珀珀亚胺胺酯（（biotin-hydroxysuccinimide，，BNHS）。。末端端羧基基可与与蛋白白质、、糖类类和酶酶等多多种类类型的的大小小分子子形成成生物物素化化的产产物。。亲和素素与生生物素素的结结合，，虽不不属免免疫反反应，，但特特异性性强，，亲和和力大大，两两者一一经结结合就就极为为稳定定。由由于1个亲亲和素素分子子有4个生生物素素分子子的结合合位置置，可可以连连接更更多的的生物物素化化的分分子，，形成成一种种类似似晶格格的复复合体体。因因此把把亲和和素和和生物物素与与ELIS偶联联起来来，就就可大大提高高ELISA的的敏感感度。。桥联法法ABC-ELISA（（avidinbiotincomplex-ELISA））夹心心法测测抗原原的过过程广泛应应用于于生物物医学学实验验研究究的各各个领领域，，既可可用于于微量量抗原原、抗抗体及及受体体的定定量、、定性性检测测及定定位观观察研研究，，亦可可制成成亲和和介质质用于于上述述各类类反应应体系系中反反应物物的分分离、、纯化化。9、静静夜夜四四无无邻邻，，荒荒居居旧旧业业贫贫。。。。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。03:52:3503:52:3503:5212/29/20223:52:35AM11、以我独独沈久，，愧君相相见频。。。12月-2203:52:3503:52Dec-2229-Dec-2212、故故人人江江海海别别，，几几度度隔隔山山川川。。。。03:52:3503:52:3503:52Thursday,December29,202213、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。12月月-2212月月-2203:52:3503:52:35December29,202214、他乡乡生白白发，，旧国国见青青山。。。29十十二二月20223:52:35上上午03:52:3512月月-2215、比不了了得就不不比，得得不到的的就不要要。。。十二月223:52上午午12月-2203:52December29,202216、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2022/12/293:52:3603:52:3629December202217、做前，，能够环环视四周周；做时时，你只只能或者者最好沿沿着以脚脚为起点点的射线线向前。。。3:52:36上午午3:52上午午03:52:3612月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有结结