现在分子生物学(笔记)-朱玉贤-第三版 2

第一章绪论分子生物学分子生物学的基本含义(p8)分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。分子生物学与其它学科的关系分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，凝聚了不同学科专长的科学家的共同努力。它虽产生于上述各个学科，但已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。生物化学与分子生物学关系最为密切:生物化学是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的结构、转变与新陈代谢。传统生物化学的中心内容是代谢，包括糖、脂类、氨基酸、核苷酸、以及能量代谢等与生理功能的联系。分子生物学则着重阐明生命的本质----主要研究生物大分子核酸与蛋白质的结构与功能、生命信息的传递和调控。细胞生物学与分子生物学关系也十分密切:传统的细胞生物学主要研究细胞和亚细胞器的形态、结构与功能。探讨组成细胞的分子结构比单纯观察大体结构能更加深入认识细胞的结构与功能，因此现代细胞生物学的发展越来越多地应用分子生物学的理论和方法。分子生物学则是从研究各个生物大分子的结构入手，但各个分子不能孤立发挥作用，生命绝非组成成分的随意加和或混合，分子生物学还需要进一步研究各生物分子间的高层次组织和相互作用，尤其是细胞整体反应的分子机理，这在某种程度上是向细胞生物学的靠拢。第一章序论1859年发表了《物种起源》，用事实证明“物竞天择，适者生存”的进化论思想。指出：物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的，彻底否定了“创世说”。达尔文第一个认识到生物世界的不连续性。意义：达尔文关于生物进化的学说及其唯物主义的物种起源理论，是生物科学史上最伟大的创举之一，具有不可磨灭的贡献。细胞学说细胞学说的建立及其意义德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺共同提出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的基本单位。经典遗传学两条基本规律:统一律：当两种不同植物杂交时，它们的下一代可能与亲本之一完全相同；分离规律：将不同植物品种杂交后的F1代种子再进行杂交或自交时，下一代就会按照一定的比例分离，因而具有不同的形式。1865年发表《植物杂交试验》，直到1900年才被人们重新发现。孟德尔被公认为经典遗传学的奠基人。现代遗传学Morgan及其助手第一次将代表某一特性的基因同染色体联系起来，使科学界普遍认识了染色体的重要性并接受了孟德尔的遗传学原理。Morgan特别指出：种质必须由某些独立的要素组成，我们把这些要素称为遗传因子或基因。第二节分子生物学发展简史准备和酝酿阶段（19世纪后期到20世纪50年代初）对生命本质的认识上的两点重大突破：1．确定了蛋白质是生命的主要基础物质2．确定了生物遗传的物质基础是DNA现代分子生物学的建立和发展阶段（20世纪50年代初到70年代初）这一阶段以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。在此期间的主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识DNA双螺旋发现的意义：确立了核酸作为信息分子的结构基础；提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。Crick于1954年所提出遗传信息传递的中心法则（CentralDogma）：初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段（20世纪70年代后至今）基因工程技术的出现作为标志。其间的重大成就包括：重组DNA技术的建立和发展基因组研究的发展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展基因表达调控机理细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域第三节分子生物学的主要研究内容一．DNA重组技术（recombinantDNAtechnology）定义：又称为基因工程，根据分子生物学和遗传学的原理，将一种生物的遗传物质DNA转移到另一生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达出所需要的产物。DNA重组技术的应用：利用微生物基因工程生产重组基因工程药物转基因植物和动物体细胞克隆基因表达与调控的基础研究二．生物大分子的结构功能研究三．基因组、功能基因组与生物信息学的研究基因组、蛋白质组与生物信息学基因组(Genome)：细胞或生物体一条完整单体的全部染色体遗传物质的总和。人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）：测定出人基因组全部DNA3109硷基对的序列、确定人类约5-10万个基因的一级结构。基因组、蛋白质组与生物信息学蛋白组计划（Proteomeproject）:又称为后基因组计划或功能基因组计划，用于揭示并阐明细胞、组织乃至整个生物个体全部蛋白质及其功能。生物信息学（Bioinformatics）:是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。四．基因表达调控研究第二章染色体与DNA第一节染色体(chromosome)概念：染色体(chromosome)：原指真核生物细胞分裂中期具有一定形态特征的染色质。现在这一概念已扩大为包括原核生物及细胞器在内的基因载体的总称。染色质(chromatin)：由DNA和蛋白质构成，在分裂间期染色体结构疏松，称为染色质。其实染色质与染色体只是同一物质在不同细胞周期的表现。常染色质(euchromatin)：是进行活跃转录的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染，易被核酸酶在一些敏感的位点(hypersensitivesites)降解。异染色质(heterochromatin)：在间期核中处于凝缩状态，无转录活性，也叫非活动染色质(inactivechromatin)，是遗传惰性区。在细胞周期中表现为晚复制，早凝缩，即异固缩现象(heteropycnosis)。原核细胞与真核细胞特征分析染色体特性：分子结构相对稳定能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程能够产生可遗传的变异真核细胞染色体的组成DNA30%--40%组蛋白(histone)30%--40%非组蛋白(NHP)变化很大少量RNA染色体中的蛋白质组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3及H4。非组蛋白(non-histoneprotein)：是染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，所以又称为序列特异性DNA结合蛋白。组蛋白具有如下特性：1、进化上的极端保守性。2、无组织特异性。3、肽链上氨基酸分布的不对称性。4、组蛋白的修饰作用。5、富含赖氨酸的组蛋白H5。非组蛋白：非组蛋白大约占组蛋白总量的60－70%，种类很多。（1）HMG蛋白(highmobilitygroupprotein)，能与DNA结合(不牢固)，也能与H1作用,可能与DNA的超螺旋结构有关。（2）DNA结合蛋白：可能是一些与DNA的复制或转录有关的酶或调节物质。（3）A24非组蛋白：与H2A差不多，位于核小体内，功能不祥。非组蛋白的一般特性：1.非组蛋白的多样性；非组蛋白的量大约是组蛋白的60%～70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。2.非组蛋白的组织专一性和种属专一性。C值：通常指一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象：真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。染色体中的DNA根据DNA的动力学研究，真核细胞DNA可分为：高度重复序列：几百→几万copy。如：卫星DNA和微卫星DNA。中度重复序列：10→几百copy。如：各种rDNA、tDNA及组蛋白基因。低度重复序列：2→10copy。如：血红蛋白。单拷贝序列：大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。只有一个拷贝。如：蛋清蛋白。核小体染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。核小体(nucleosome)：DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp)，形成核小体核心颗粒。（2）螺线管10nm的染色质细丝盘绕成螺旋管状的30nm纤维粗丝，通称螺线管（solenoid）。螺线管的每一螺旋包含6个核小体，其压缩比为6。这种螺线管是分裂间期染色质和分裂中期染色体的基本组分。（3）上述螺线管可进一步压缩形成超螺旋。由30nm螺线管缠绕而成一细长、中空的圆筒，直径为4000nm，压缩比是40。（4）超螺旋进一步压缩1/5便成为染色体单体，总压缩比是7×6×40×5，将近一万倍。原核生物基因组特点：1、结构简练2、存在转录单元多顺反子mRNA3、有重叠基因第二节DNA的结构一、DNA的一级结构所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。基本特点①DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。③两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。2、DNA的二级结构DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。通常情况下，DNA的二级结构分两大类：一类是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一类是左手螺旋，即Z-DNA。3、DNA的高级结构DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。DNA分子的超螺旋化可以用一个数学公式来表示：L=T+W其中L为连接数（linkingnumber），是指环形DNA分子两条链间交叉的次数。只要不发生链的断裂，L是个常量。T为双螺旋的盘绕数（twistingnumber），W为超螺旋数（writhingnumber），它们是变量。2．3DNA的复制一、DNA的复制1、DNA的半保留复制每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA的半保留复制（semiconservativereplication）。DNA的这种半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性。2、复制的起点与方向一般把生物体的复制单位称为复制子（replicon）。一个复制子只含一个复制起点。多复制子：DNA复制时，原核生物一般只有一个起始位点，而真核生物则有多个起始位点，因而在复制时呈现多复制泡，也称为多复制子。DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的（图2-18）。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。拓扑异构酶I拓扑异构酶I解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。参与解链的除一组解链酶外，还有Dna蛋白等。DNA解链酶（DNAhelicase）DNA解链酶能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。单链结合蛋白（SSB蛋白）SSB蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。所以，SSB蛋白只保持单链的存在，并不能起解链的作用。3、DNA的半不连续复制与冈崎片段冈崎片段：DNA半不连续复制复制中产生长度为1000~2000个碱基的短的DNA片段，能被连接形成一条完整的DNA链。DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶连成大分子DNA。现在已知一般原核生物的冈崎片段要长些，真核生物中的要短些。进一步研究还证明，这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为双螺旋的半不连续复制。DNA链的延伸：DNA复制体(replisome)：在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和解链酶构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体。4、滞后链的引发DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3'端开始合成新的DNA链。滞后链的引发过程往往由引发体（primosome）来完成。引发体由6种蛋白质n、n'、n''、DnaB、C和I共同组成，只有当引发前体（preprimosome）把这6种蛋白质合在一起并与引发酶（primase）进一步组装后形成引发体，才能发挥其功效。5、链的终止当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。6、复制的几种方式(1)环状DNA双链的复制环状双链DNA的复制可分为θ型、滚环型和D-环型几种类型。(a)θ型复制的起始点涉及到DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉。前导链DNA开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短RNA链，作为起始DNA复制的引物。(b)滚环型（rollingcircle）这是单向复制的特殊方式。如ΦX174的双链环状DNA复制型（RF）就是以这种方式复制的。DNA的合成由对正链原点的专一性切割开始，所形成的自由5‘端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，使其3’—OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸。在这个过程中，单链尾巴的延伸与双链DNA的绕轴旋转同步。（c）D-环型（D-loop）这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环（即D-环）。（2）线性DNA双链的复制线性DNA复制中RNA引物被切除后，留下5'端部分单链DNA，不能为DNA聚合酶所作用，使子链短于母链。T4和T7噬菌体DNA通过其末端的简并性使不同链的3'端因互补而结合，其缺口被聚合酶作用填满，再经DNA连接酶作用生成二联体。这个过程可重复进行直到生成原长20多倍的多联体，并由噬菌体DNA编码的核酸酶特异切割形成单位长度的DNA分子。二、原核和真核生物DNA的复制特点1、原核生物DNA的复制特点大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较原核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ：有3’→5’外切酶活性和5’→3’外切酶活性。保证DNA复制的准确性。DNA聚合酶Ⅱ：活性低，其3’→5’核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修复DNA的作用。DNA聚合酶Ⅲ：7种亚单位9个亚基。只具3’→5’外切酶活性，主导聚合酶。三、真核生物DNA的复制特点真核生物DNA复制的起始需要起始原点识别复合物（ORC）参与。真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp秒，还不到大肠杆菌的120。真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始。真核生物DNA聚合酶的特性比较2.4.3DNA复制的调控原核细胞DNA的复制调控：复制叉的多少决定了复制频率的高低。真核细胞DNA的复制调控：1.细胞生活周期水平调控2.染色体水平调控3.复制子水平调控真核和原核生物DNA复制的比较相同：1.半保留复制2.都有引发、延长、终止三个阶段3.都必须有相应功能的蛋白质和DNA聚合酶参与区别：1.真：多个复制起始点；原：一个复制起始点2.真：所有复制受一种调控；原：一个复制子上有多个复制叉2.5DNA的修复DNA修复系统功能错配修复恢复错配碱基切除修复切除突变的碱基核苷酸切除修复修复被破坏的DNADNA直接修复修复嘧啶二体或甲基化DNA重组修复SOS反应2.6DNA的转座移动基因(Movablegene)：又称为转位因子(Transposableelements)，是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一位置，甚至在不同染色体之间跃迁，因此有时也称为跳跃基因(Jumpinggene)。原核生物的转座因子可分为：插入序列(insertionsequence，IS)：最简单的不含有任何宿主基因的转位因子。片段长度700—2500bp。复合转座子(transposon，Tn)：是一类携带某些与转座无关的抗性基因(或其它宿主基因)的转座子。分子量＞2000bp。转座噬菌体(Mu，D108)：具有转座功能的一类可引起突变的溶源性噬菌体。插入序列的结构特点：1.在IS两端含有长度为10—40bp反向重叠序列2.含有一个编码转座酶的长编码区。3.插入时在DNA位点产生一个短的(3—9bp)正向重复序列。复合转座子的结构特点：1.两翼为两个相同或相似的IS序列。2.中部为某种抗性基因。3.IS序列一般不能单独移动。转座作用的遗传学效应1.诱变效应（提高重组频率、形成易变基因…）2.切除效应(倒位、缺失、重复、footprinting)3.双转座效应（外显子改组exonshuffling）4.位置效应（启动表达、增强表达…）5.转座爆炸（激活表达、基因内重排突变基因形成）转位作用的机制：靶序列的复制。转位作用的遗传学效应：引起插入突变；产生新基因；产生染色体畸变；引起生物进化。转座因子的应用：利用转座子分离、克隆基因；利用Tn进行基因定位；作为基因转移载体。真核生物中的转座子1、玉米中的控制因子自主性因子：具有自主剪接和转座的功能；非自主性因子：单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能，成为与自主性因子相同的转座子。Ac－Ds体系、Spm,En转座子。2、果蝇中的转座子Copia类、P转座子等。生物信息的传递(上)—从DNA到RNA基因表达：是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。转录(transcription)：以DNA为模板，按照碱基互补原则合成一条单链RNA，从而将DNA中的遗传信息转移到RNA中去的过程称为转录。编码链(codingstrand)=有意义链模板链(templatestrand)=反义链不对称转录(asymmetrictranscription)：转录仅发生在DNA的一条链上。启动子(promoter)：是DNA转录起始信号的一段序列，它能指导全酶与模板正确的结合，并活化酶使之具有起始特异性转录形式。终止子(terminator)：转录终止的信号，其作用是在DNA模板特异位置处终止RNA的合成。转录单位：DNA链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。3.1RNA的转录转录的基本过程都包括：模板识别、转录起始、转录延伸、转录终止。1、模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。2、转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。3、转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。4、RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。5、当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，这就是转录的终止。3.1.1转录的基本过程RNA合成的基本特点：1.底物是：ATP、GTP、CTP、UTP2.在聚合酶作用下形成磷酸酯键3.RNA的碱基顺序由DNA的顺序决定4.仅以一条DNA链作为模板5.合成方向为5’→3’6.合成中不需要引物3.1.2转录机器的主要成分原核生物RNA聚合酶：亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA3.65×1042核心酶核心酶组装，启动子识别1、RNA聚合酶大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65×105。研究发现，由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，加入σ因子以后，RNA聚合酶全酶识别启动子序列的特异性总共提高了107倍。σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始,转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动子-酶复合物相结合构成新生RNA的5’端，再以磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合，起始的终止反映在σ因子的释放。过去认为二核苷酸的形成就是转录起始的终止，实际上，只有当新生RNA链达到6-9个核苷酸时才能形成稳定的酶-DNA-RNA三元复合物，才释放σ因子，转录进入延伸期。真核生物RNA聚合酶真核生物中共有3类RNA聚合酶。真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。除了细胞核中的RNA聚合酶之外，真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的RNA聚合酶。线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，相对分子质量小于7×104，是已知最小的RNA聚合酶之一，与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性。叶绿体RNA聚合酶比较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组编码。线粒体和叶绿体RNA聚合酶活性不受α-鹅膏覃碱所抑制。起始复合物的形成转录可被分为4个阶段，即启动子的选择、转录起始、RNA链的延伸和终止。原核生物中：启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closedcomplex）。真核生物RNA聚合酶Ⅱ所形成的转录起始复合物：除了RNA聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与一般情况下，该复合物可以进入两条不同的反应途径，一是合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物，即所谓的流产式起始；二是尽快释放σ亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。RNA聚合酶的核心酶虽可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位点。只有带б因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，选择其中一条链作为模板，合成均一的产物。б因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责RNA链的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。真核生物RNAPolII的转录起始复合物真核生物转录起始除RNA聚合酶外，至少还需要7种辅助因子参与，如TBP，TFIIA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH。2、启动子与转录起始启动子：是一段位于结构基因5’端上游区大约100~200bp以内的具有独特功能的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与范本DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。3.2.1启动子区的基本结构转录单元(transcriptionunit)：是一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5’末端的序列称为上游(upstream)，而把其后面即3’末端的序列称为下游(downstream)。在启动子区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区(Pribnowbox)，这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。绝大部分启动子都存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区。这两段共同序列是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。Pribnow区（Pribnowbox）这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为–10区。TTGACA。这个区的中央大约位于起点上游35bp处，所以又称为–35区。–10位的TATA区和–35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribnow区的Hogness区（Hognessbox），这是位于转录起始点上游–25～–30bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区（图3-7）。另外，在起始位点上游–70～–78bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中–35bp区相对应的序列，称为CAAT区（CAATbox）。在–70～–80区含有CCAAT序列（CAATbox），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GCbox）。3.2.2启动子区的识别氢键互补学说：RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受DNA序列影响，又受其构象影响这一事实。3.2.3酶与启动子区的结合在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。DNA开链是按照DNA模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。3.2.4-10区和-35区的最佳间距在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。在细菌中常见两种启动子突变，一种叫下降突变(downmutation)，如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平；另一类突变叫上升突变(upmutation)，即增加Pribnow区共同序列的同一性。3.2.5增强子及其功能能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。增强子很可能通过影响染色质DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与范本DNA相结合，起始基因转录。增强子与启动子的区别：1.增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动；2.它能在两个方向产生作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。3.2.6真核生物启动子对转录的影响习惯上，将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件(upstreampromoterelement，UPE)或称上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribnow区的Hogness区（Hognessbox），这是位于转录起始点上游–25～–30bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区。另外，在起始位点上游–70～–78bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中–35bp区相对应的序列，称为CAAT区（CAATbox）。在–70～–80区含有CCAAT序列（CAATbox），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GCbox）。TATA区的主要作用是使转录精确地起始；CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。转录的终止RNA聚合酶起始基因转录后，它就会沿着范本5’→3’方向不停地移动，合成RNA链，直到碰上终止信号时才与模板DNA相脱离并释放新生RNA链。终止发生时，所有参与形成RNA-DNA杂合体的氢键都必须被破坏，范本DNA链才能与有意义链重新组合成DNA双链。3.4终止和抗终止不依赖于ρ因子的终止终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产物的3’端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡式结构（至少6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率逐步提高。依赖于ρ因子的终止ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷酸三磷酸，实际上是一种NTP酶，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。3.4.3抗终止抗转录终止主要有两种方式：1.破坏终止位点RNA的茎—环结构2.依赖于蛋白质因子的转录抗终止3.3原核生物与真核生物mRNA的特征比较3.3.1原核生物mRNA的特征1.原核生物mRNA的半衰期短2.许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在3.原核生物mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的poly(A)结构原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列（Shine–Dalgarnosequence）的保守区，因为该序列与16S-rRNA3’端反向互补，所以被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA（monocistronicmRNA），把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA（polycistronicmRNA）。多顺反子mRNA是一组相邻或相互重迭基因的转录产物，这样的一组基因可被称为一个操纵子（operon），是生物体内的重要遗传单位。如大肠杆菌乳糖操纵子转录成编码3条多肽的多顺反子mRNA，经过翻译生成β半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶。真核生物mRNA的特征前体RNA成熟mRNA“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！3.3.2真核生物mRNA的特征1.真核生物mRNA的5’端存在“帽子”结构：pppApNpNp。2.绝大多数真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。3、帽子结构的功能（1）对翻译起识别作用------为核糖体识别RNA提供信号（2）增加mRNA的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击（3）与某些RNA病毒的正链合成有关除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化－－－m6A形式PolyA尾巴3、poly(A)的功能（1）可能与核质转运有关（2）与mRNA的寿命有关（3）与翻译有关（4）poly(A)在分子生物学实验中有很大应用价值a、也可将oligo(dT)与载体相连，从总体RNA中分离纯化mRNAb、用寡聚dT（oligo(dT)）为引物，反转录合成cDNA模板单链DNA的极性方向为3’→5’,而非模板单链DNA的极性方向与RNA链相同，均为5’→3’.3.5内含子的剪接、编辑及化学修饰一、概述内含子（intron）：原初转录物中通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列或基因中与这些RNA序列相应的DNA序列3.5.1RNA中的内含子真核生物mRNA前体的加工：1.5’端形成特殊的帽子结构2.在3’端切断并加上一个poly(A)的尾巴3.通过剪接除去转录来的IVS(非翻译区)4.链内部核酸的甲基化3.5.2RNA的剪接RNA的剪接实质：就是要把断裂基因的内含子除去，连接外显子。剪切方式：mRNA前体的剪接；自我剪接；蛋白质剪接(tRNA)。剪接体(spliceosome)：各种参与剪接的成分形成的一个体系。Ribozyme：有酶活性的RNA。3.5.3RNA的编辑和化学修饰RNA的编辑：是在mRNA水平上改变遗传信息的过程。种类：单碱基突变；尿苷酸的缺失和添加化学修饰：甲基化；硫代；二价键的饱和化；去氨基化；碱基的同分异构化；核苷酸的替代。1.真核生物mRNA转录后的成熟步骤主要包括①5’端形成特殊的帽子结构②在3’端切断并加上一个poly(A)的尾巴③通过剪接除去转录来的IVS(非翻译区)④链内部核酸的甲基化生物信息的传递(下)—从mRNA到蛋白质4.1遗传密码—三联子1、mRNA与蛋白质之间的联络是经过遗传密码的破译来完成的4.1.1三联子密码及其破译遗传密码(code)：mRNA中蕴藏遗传信息的碱基顺序称为遗传密码,密码是密码子的总和。密码子(codon)：mRNA中每个相邻的三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子。阅读框(readingframe)：遗传密码是三个一读，称为阅读框。AUG：蛋氨酸(Met)或起始密码UAA、UAG、UGA：终止密码UAG—琥珀型(amber)密码子UGA—蛋白石(opal)密码子UAA—赭石型(ochre)密码子三联体密码的破译：以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指点多肽的分解核糖体结合技术4.1.2遗传密码的性质1.密码的简并性：简并(Degenracy)：由一种以上密码子编码同一种氨基酸的景象称为简并。同义密码子(Synonymouscodons)：对应于同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。2.密码的普遍性与特殊性：普遍性：无论在体外还是体内，也无论是病毒、细菌、植物还是植物，遗传密码均适用。特殊性：线粒体密码子，其它例外(支原体、四膜虫)密码子与反密码子的互相作用：反密码子(anticodon)：指tRNA上能辨认一个mRNA密码子的地位，这个地位上的碱基与密码子的碱基是互补的。所谓“摆动假说”(Wobblehypothesis)：即密码的第一、第二碱基是必需严厉依照规范配对(A-U、G-C)，而第三碱基则可以有一定水平的摆动灵敏性。4.3核糖体由几十种蛋白质和几种rRNA组成。包括两个亚基，大亚基约为小亚基绝对分子质量的一倍。每个亚基包括一个次要的rRNA成分和许多不同功用的蛋白质分子。核糖体上有不止一个的活性中心，每一个这样的中心都由一组特殊的蛋白质构成。核糖体的根本功用依赖于其中的rRNA，核糖体蛋白质起着增强rRNA功用的作用。多聚核糖体(polyribosome)：在执行蛋白质分解功用时，单个核糖核蛋白体常常5-6个或更多个串联在一同，构成一个聚合体，称为多核蛋白体或多核糖体(polyribosome或polysome)。rRNA1、5SrRNA:含与tRNA和23SrRNA辨认序列2、16SrRNA：含与mRNA5’端和23SrRNA互补序列。3、23SrRNA：存在一段能与tRNAMet序列互补的片段，5SrRNA互补序列。4、5.8SrRNA：与tRNA作用的辨认序列，同5SrRNA。5、18SrRNA：与16SrRNA同源。6、28SrRNA4.3.3核糖体的功用核糖体必需包括至多5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或承受AA-tRNA部位（A位）、结合或承受肽基tRNA的部位、肽基转移部位（P位）及构成肽键的部位（转肽酶中心）。核糖体小亚基担任对模板mRNA停止序列特异性辨认，如起始局部的辨认、密码子与反密码子的互相作用等，mRNA的结合位点也在此亚基上大亚基担任携带氨基酸及tRNA的功用，肽键的构成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等，A位、P位、转肽酶中心等次要在大亚基上。4.4

蛋白质合成的生物学机制4.4.1

氨基酸的活化氨基酸必须在氨基酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸——AA-tRNA。tRNA与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤，因为只要tRNA携带了正确的氨基酸，多肽合成的准确性就相对有了保障。4.4.2

翻译的起始起始密码子和起始信号：1.mRNA上的起始密码子常为AUG，少数为GUG在mRNA起始密码子上游8-13个核苷酸的地方往往有一段富含嘌呤的序列，称为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它和16SrRNA3’端有一个互补的序列，它们互相识别，以保证起始的正确性。翻译的起始：第一步，30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，再在SD序列的帮助下与mRNA模板结合。第二步，在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。第三步，带有tRNA，mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子原核生物的翻译的起始因子：IF-1

9.5kd

加强IF-2，IF-3的酶活IF-2

95kd-117kd

促使fMet-tRNAfMet选择性的结合在30S亚基上IF-3

20kd

促使30S亚基结合于mRNA起始部分，阻碍30S与50S亚基的结合真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5'端的“帽子”参与形成翻译起始复合物。真核生物的翻译的起始因子：

eIF2

3种亚基

形成三元起始复合体(eIF2,GTP,tRNA)

eIF2-A

65kd

Met-tRNAmet与40S亚基结合

eIF1

15kd

促使mRNA与40S亚基结合

eIF3

＞500kd

促使mRNA与40S亚基结合

eIF4b

80kd

促使mRNA与40S亚基结合

eIF4a

50kd

促使与mRNA，GTP结合

eIF4c

19kd

促使两亚基结合

eIF5

150kd

释放eIF2，eIF3

eIF4e(eIF4f的亚基)

与5’端帽子结合4.4.3

肽链的延伸过程：后续AA-tRNA与核糖体结合

肽链的生成

移位延伸因子：EF-Tu，EF-Ts，EF-G(原核生物)

EF-1,EF-2(真核生物)

2个GTP后续AA-tRNA与核糖体结合细菌中肽链延伸的第一步反应：第二个氨基酰-tRNA的结合。该氨基酰-tRNA首先与EF-Tu·GTP形成复合物，进入核糖体的A位，水解产生GDP并在EF-Ts的作用下释放GDP并使EF-Tu结合另一分子GTP，进入新一轮循环。肽键的生成核糖体·mRNA·AA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，fMet-tRNAfMet占据P位。在肽基转移酶（peptidyltransferase）的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，与fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽键。起始tRNA在完成使命后离开核糖体P位点，A位点准备接受新的AA-tRNA，开始下一轮合成反应。移位肽键延伸过程中最后一步反应是移位，即核糖体向mRNA3'端方向移动一个密码子。此时，仍与第二个密码子相结合的二肽基tRNA2从A位进入P位，去氨基酰-tRNA被挤入E位，mRNA上的第三位密码子则对应于A位。EF-G是移位所必须的蛋白质因子，移位的能量来自另一分子GTP水解。4.4.4

肽链的终止终止因子：原核生物有3种蛋白因子:RF1、RF2、RF3。RF1用于识别终止密码子UAA、UAG；RF2帮助识别UAA、UAG；RF3不识别终止密码子，主要是协助肽的释放。一旦tRNA从核糖体上脱落，则核糖体立即离开mRNA，并解离成50S和30S亚基，核糖体可以重复使用。真核生物仅一种：RF4.4.5

蛋白质前体的加工N端fMet或Met的切除2.二硫键的形成：蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化形成3.特定氨基酸的修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化4.切除新生肽链中的非功能片段糖蛋白中常见的糖—肽连接键：N—糖苷键：β-N-乙酰氨基葡萄糖基-天冬酰胺(GlcNAc-Asn)O—糖苷键：α-N-乙酰氨基半乳糖基-丝氨酸/苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr)4.5

蛋白质运转机制蛋白质运转类别若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的，则属于翻译运转同步机制；若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，则属于翻译后运转机制。这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系。4.5.1

翻译—运转同步机制信号序列(signalsequence)：在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，这个氨基酸序列就被称为信号序列。信号肽(signalpeptide)：绝大多数越膜蛋白的N端都具有长度大约在13-36个残基之间的以疏水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。信号肽的结构特点：一般带有10-15个疏水氨基酸.常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸.在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(Ala或Gly)信号序列的基本作用：通过与SRP的识别和结合，引导核糖体与内质网结合.通过信号序列的疏水性，引导新生肽跨膜转运SRP&DP信号识别颗粒(signalrecognitionpartical，SRP)：是一种核糖核酸蛋白复合体，它的作用是识别信号序列，并将核糖体引导到内质网上。停靠蛋白(dockingprotein，DP，又称SRP受体蛋白)：即SRP在内质网膜上的受体蛋白，它能够与结合有信号序列的SRP牢牢地结合，使它在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上来。信号肽假说(signalhypothesis)：提出：G.Blobel&B.Dobborstein(1975)证明：基因重组实验核心内容：核糖体同内质网的结合受制于mRNA中特定的密码序列(可以翻译成信号肽)，具有这种密码序列的新生肽才能连同核糖体一起附着到内质网膜的特定部位。已知野生型细胞中，β-半乳糖酶定位于胞质内，麦芽糖结合蛋白定位于胞外，麦芽糖运转蛋白位于外膜内腔。如果把β-半乳糖酶羧基端基因片段与麦芽糖运转蛋白和麦芽糖结合蛋白的氨基端基因片段相连，并以此为模板指导合成杂种蛋白质，就可以通过测定β-半乳糖酶的活性确定杂种蛋白质在细胞内的位置。4.5.2

翻译后运转机制翻译后运转机制线粒体蛋白质的跨膜运转

通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后再运转的。这个过程有如下特征：①通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽（leaderpeptide）共同组成。②蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需能过程；③蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。前导肽的作用与性质拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，失去继续跨膜能力。前导肽一般具有如下特性：带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间；缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸（特别是丝氨酸）含量较高；有形成两亲（既有亲水又有疏水部分）α-螺旋结构的能力。叶绿体蛋白质的跨膜运转叶绿体定位信号肽一般有两个部分，第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二部分决定该蛋白能否进入类囊体。在这一模型中，蛋白质运转是在翻译后进行的，在运转过程中没有蛋白质的合成。叶绿体蛋白质运转过程有如下特点：①活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内，这是鉴别翻译后运转的指标之一。②叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。③叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。4.5.3核定位蛋白的运转机制核定位序列（NLS—NuclearLocalizationSequence）NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白质向核内运输过程需要一系列循环于核内和细胞质的蛋白因子包括核运转因子（Importin）α、β和一个低分子量GTP酶（Ran）参与。由上述三个蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依靠RanGTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核，α和β亚基解离，核蛋白与α亚基解离，α和β分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。细菌同样能通过定位于蛋白质N-端的信号肽将新合成的多肽运转到其内膜、外膜、双层膜之间或细胞外等不同部位。基因分离方法一、基因表达调控的基本概念与原理1.基本概念：基因表达(geneexpression)：从DNA到蛋白质的过程称为基因表达，基因表达的实质就是遗传信息的转录和翻译。基因表达的调控(generegulationorgenecontrol)：对基因表达过程的调节就称为基因表达调控。2.基因表达的时间性及空间性基因表达的时间特异性(temporalspecificity)是指特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生，以适应细胞或个体特定分化、发育阶段的需要。故又称为阶段特异性。基因表达的空间特异性（spatialspecificity）是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因的表达在不