重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选培训课件

重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选第一节

重组DNA向宿主细胞的导入第二节

转化子的筛选与鉴定第三节

目的基因序列测定2重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选第一节

重组DNA向宿主细胞的导入

一、转化二、通过接合作用传递质粒DNA三、通过转染/转导作用传递遗传物质3重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选一、转化:以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞1928年,美国的Oswald,Avery首次开展了肺炎球菌的转化试验感受态细菌是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如E.coli。产生机制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。常见转化方法有㈠原生质体转化法；㈡化学转化法；㈢电穿孔法。4重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选㈠原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。㈡化学转化法:1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。1.原理：将对数生长期的细菌在0℃下,用预冷的CaCl2溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加,菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内。用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形，外源DNA被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不被降解，转化效率达105-106，它与菌株（hsdR-).2.方法:（1）感受态细菌的制备

（2）转化5重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选（1）感受态细菌的制备接种一环DH5于2mlLB中37℃，振荡过夜以约1%的接种量接入20mlLB中振荡培养约90’至OD600≈0.2离心（5K，5’）收集菌体加入预冷CaCl2（10ml100mM）冰浴20’离心收集菌体

加入100ul100mM预冷CaCl2混匀6重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照——10ulPBR322DNAlng100ul

b阴性对照①10ul——2ul连接液100ul

c阴性对照②——10ul——100ul

d连接液转化组——60ul6ul连接液600ul

（2）转化：

0℃，在1.5ml离心管中按下表加入CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验冰浴30’42℃2’（热休克）冰浴，2’

加37℃预热LB培养45’表中a、b、c各取100ul/皿涂布（连接液转化组d梯度涂布I50ul2皿；II.500ul浓缩后2皿）37℃倒置培养过夜检查细菌生长情况7重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选㈢电穿孔法原理：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,在脉冲过后,微孔复原。它比CaCl2法操作更简单，转化效率高（一般可达109～1010个转化子／μgDNA）,不仅无需制备感受态细胞,而且适用于任何菌株。8重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选二、通过接合作用传递质粒DNA

F质粒（F因子）又称性质粒,除了含有自我复制基因外,还带有一套接合转移的基因,凡携有F质粒的细菌称F+菌株。不带有F质粒的细菌称F－菌株。F+菌株（供体菌）一旦与F－菌株（受体菌）发生接触，F+菌株可通过性菌毛将F质粒转给F－菌株，使F－­菌株转变成

F+菌株。质粒由F+向F－菌的转移过程叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。凡带有在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系（Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传递质粒DNA,F+菌株可失去F质粒,F－菌也可获得F质粒,其转移难以人为控制,又不稳定，通常不用作克隆载体。9重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选接合----F+×F－F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient10重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选三、通过转染/转导作用传递遗传物质㈠转染病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。㈡转导以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。原理：1.重组外源基因的噬菌体DNA,体外包装成噬菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重组噬菌体DNA导入宿主菌体内11重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选第二节

转化子的筛选与鉴定一、利用遗传标志的表型特征筛选二、根据重组子的结构特征筛选12重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选一、利用遗传标志的表型特征筛选㈠由载体提供的性状进行筛选1.抗菌素抗性标记筛选2.抗性基因的插入失活筛选3.β-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活筛选法及其α-互补的原理㈡根据插入基因的遗传性状进行筛选

亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长，当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。

13重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选Ampicillin抗性?yes

yesTetracycline抗性?NoyesBXBBBXAmproriAmprTcroriAmprTcroripBR322B14重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选backtransferofcolonies+ampicillin+ampicillin+tetracycline这些克隆是有重组质粒的细菌15重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选编码b-半乳糖苷酶

IPTGX-gal(酶的底物)lacpromoter蓝色菌落IPTG可诱导lacZ形成α肽链,该产物能与有缺陷的宿主细胞所编码的N-末端发生基因内互补，形成有活性的β-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。当外源基因DNA片段插入多克隆位点后,使其编码的α肽链失去活性,使其不能形成α-互补,因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。

16重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选非重组质粒:不含有插入的DNA蓝色菌落重组质粒:含有插入的DNA:白色菌落back非重组质粒重组质粒17重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选α-互补的原理所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性,进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝,使菌落呈现出蓝色反应。然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZα肽区段的多克隆位点后,就会阻断α序列的读码结构,使其编码的α肽失去活性,使重组子所在的细菌不能完成α-互补,因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。如图5-118重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选二、根据重组子的结构特征筛选1.重组子大小鉴别筛选菌落——提取质粒——单酶切——电泳原质粒2.酶切鉴定菌落——提取质粒——双酶切——电泳原质粒3.PCR筛选法能与插入基因片断两端互补的特异引物,以少量抽提的重组子DNA为模板,进行PCR分析

19重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选4.原位杂交图5-3、5-4该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。5.斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来,麻烦2)抽提纯化,蛋白质、杂DNA等减少,所以能得到更为确切的结果,既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。6.Southernblot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段,而Southernblot杂交能将同源片断定位于基因20重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选同尾酶BamHI和BglII

AGATCT

GGATCC

TCTAGA

CCTAGGBglⅡBamHI

AGATCC

TCTAG T4连接酶G

AGATCC

TCTAGG21重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选22重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选23重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选24重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选肺炎双球菌转化实验25重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选第三节

目的基因序列测定

一、目的基因序列测定的意义

美国联邦国家人类基因组研究项目负责人弗朗西斯·柯林斯博士在华盛顿隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。由美、英、日、法、德和中国科学家经过13年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，在人类揭示生命奥秘、认识自我的漫漫长路上又迈出了重要的一步。

26重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选酶法——双脱氧链的末端终止法1.Sanger双脱氧末端终止法：因掺入dd-NTP的链不能再延长而形成不同长度的末端为A、G、C、T的片段。图5-52.Sanger双脱氧-M13体系测序法：采用M13噬菌体组装基因后，再由引物合成不同长度末端为A、G、C、T的片段图5-63.Sanger双脱氧-PUC体系测序法：类似M13体系，只是由PUC体系替代M13噬菌体，再由引物合成不同长度末端为A、G、C、T的片段。图5-728重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选①双脱氧－M13体系DNA序列分析法

M13含单链DNA，在细菌内形成双链环状DNA（RF）。成熟的噬菌体含单链DNA分泌到培养液中。双链DNA（RF）：克隆载体，按提取质粒方法从细菌中制备单链DNA：测序模板，从培养基的上清中提取目前常用的M13mp18图5-629重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选30重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选㈡化学（裂解）法在无NaCl下，用联氨（肼）可打开C、T碱基，在C、T碱基发生断裂，形成T+C组。加入NaCl，肼切割C形成C组。在中性条件下，硫酸二甲酯可在G处断开形成G组。加入甲酸可在A、G处断开，形成G+A组，最后电泳经感光读片，自动分析得到测序结果。如、图5-9

5-1031重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选全自动DNA测序仪末端终止