免疫组织化学及相关技术之亲和免疫组织化学技术

免疫组化相关的组织学和细胞学技术免疫酶组织化学技术亲和免疫组织化学技术免疫荧光组织化学技术免疫组织化学技术（immunohistochemistry)

直接法---

将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。

间接法---两步法

+一抗（细胞组织内抗原的特异性抗体）

+二抗（酶标记抗一抗的抗体）注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,

因为第二抗体是用第一抗体同种动物IgG的Fc段（恒定区，有种属特异性）免疫动物所制备。酶标抗体免疫组织化学染色法非标记抗体酶法酶桥法：

+一抗（抗原特异性抗体）

+二抗（桥抗体，有种属特异性）

+三抗（特异性抗酶抗体，用酶如HRP免疫动物）

+酶(如HRP）

+底物（如DAB/H2O2)，反应显色PAP法

+一抗（抗原特异性抗体）

+二抗（桥抗体，有种属特异性）

+PAP复合物（特异性抗酶抗体-酶）

+底物，反应显色注意：一抗、三抗同物种，二抗为抗此物种Fc的抗抗体.

1.EPOS法（一步法，DAKO公司近年推出）

+一抗—多聚化合物—酶多聚螯合物酶法——放大信号

2.EnVision法（两步法，DAKO公司1995年推出）

+一抗（抗原特异性抗体）

+二抗—多聚化合物—酶注意：二抗为抗一抗Fc段的抗抗体（种属特异性），应用广泛。免疫组化技术成熟的过程，目的？

提高IHC敏感性！

=放大信号

=抗原酶

EnVision法

亲和免疫组织化学技术：

ABC法、SABC法、SP法…….

+？P48四.亲和免疫组织化学技术

（affinityimmunohistochemistry）

亲和免疫组织化学：

免疫酶组织化学能在待检部位形成有色沉淀亲和组织化学能有效放大抗原信号的特点敏感性增加，背景清晰，操作省时，应用广泛。

亲和组织（细胞）化学：（affinityhistochemistry/cytochemistry）

利用两种亲和物质（生物素，SPA等）之间的高度亲和力,

来进行组织或细胞化学检测的技术。结合形成亲和组织化学中的亲和物质亲和素+生物素葡萄球菌A蛋白（SPA）+IgG植物凝集素+糖类阳离子+阴离子激素+受体……………

最常用的亲和组织化学系统（BAS）：1.生物素(Biotin)：VitaminH、活化后可标记抗体和酶而不影响其活性；细胞经标记后仍能正常生长、增殖、分裂。2.卵白素(Avidin):亲和素、抗生物素碱性糖蛋白；具有4个生物素结合位点；

还能与示踪物质（酶、胶体金、荧光素等）结合。3.链霉卵白素：从链霉菌中提取，等电点接近中性，对组织细胞的非特异吸附很低，是一种更完美的生物素结合蛋白。4.生物素-卵白素、生物素-链霉卵白素系统：

具有高度亲和力，比抗原抗体的亲和力高百万倍。ABC法、SABC法、SP法、……

（一）亲和素-生物素免疫细胞化学术1.亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术(ABC法)

Avidin-Biotin-PeroxidaseComplextechnique

生物素（Biotin）：VitaminH

活化后可标记抗体和酶而不影响其活性。

亲和素（affinitin）：卵白素（avidin）抗生物素（anti-biotin）碱性糖蛋白；具有4个生物素亲和位点；可标记示踪物质酶。

ABC复合物：

亲和素-生物素-过氧化物酶复合物

亲和素（做桥）生物素化酶生物素（Biotin）标记的酶+亲和素（affinitin）/抗生物素（anti-biotin）

/卵白素（Avidin）预制备ABC复合物

（Avidin-Biotin-PeroxidaseComplex）注意：亲和素具有4个生物素结合位点。制备时，亲和素与一定浓度的生物素化酶混合，保证复合物中至少还有一个未被占据的生物素结合位点。特点：亲和素作为“桥”，将生物素化的抗体与生物素化的酶(HRP)连接起来。与PAP法相似，共有三个抗体：原理：

+第一抗体（未标记的相关抗原特异性抗体）

+第二抗体（生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合）

+生物素-亲和素-过氧化物酶复合物ABC

（剩余的亲和素结合位点可与二抗的生物素结合）

+底物，显色反应1.亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术(ABC法)Avidin-Biotin-PeroxidaseComplextechniqueABC法原理示意图一抗生物素化二抗ABC复合物

1.

器材同免疫酶直接法2．试剂正常羊血清（封闭），大鼠抗小鼠IL-6抗体（一抗），

Bio-羊抗鼠IgG（桥抗体），亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC复合物，用前30min配制）

DAB，H2O2，苏木精(或甲基绿)，乙醇，二甲苯，树胶3．操作步骤

4.结果分析

ABC法实验操作ABC法显示小鼠胸腺IL-6阳性细胞

（Question：胸腺的结构？功能？细胞？）阳性细胞（巨噬细胞）胞质棕黄色，细胞核绿色（甲基绿）

5.注意事项（1）内源性生物素活性及其消除：

内源性生物素活性:

某些组织和细胞(肾小管上皮细胞，肝细胞、唾液腺的纹状管上皮细胞、白细胞、乳腺等)具有较强生物素活性，使用本法染色时，会与抗生物素结合而产生非特异性染色.

消除办法：卵白素-生物素阻断法。在进行ABC染色前应预先以0.01%的抗生物素和0.01%生物素溶液分别作用20min以消除内源性抗生物素结合活性，每次作用后，用PBS漂洗5min*3次。

也可改用与生物素无关的其他检测系统(如Envision)。（2）ABC试剂保存温度

以4℃为佳，可达2年之久。

-20℃时其生物活性反而在短期内被破坏。（3）在某些组织中容易造成背景染色。

亲和素中含有糖类，易与组织中的糖基反应；等电点高，带较多负电荷，易与组织中的正电荷物质结合。

（Howtoimprove？）

5.注意事项原理：基本与ABC法相似。特点：链酶亲和素（Streptavidin,SA）代替亲和素。

SA是一种从链酶菌StreptomycesAvidinii培养物中提取的蛋白质。也有四个生物素结合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。SABC复合物：

链酶亲和素同一定浓度的生物素化酶混合后形成

链酶亲和素－生物素－酶复合物（SABC）。这种复合物至少存在一个尚未被生物素占据的亲和素结合位点，可以和各种生物素标记的抗体结合。2.链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术

（StreptAvidin-Biotin-Complex，SABC法）

SABC法原理示意图一抗生物素化二抗SABC复合物（链霉亲和素-生物素-过氧化物酶）操作：+一抗（未标记的相关抗原特异性抗体）

+二抗（生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合）

+SABC复合物（链霉亲和素代替亲和素）剩余的亲和素结合位点可与二抗的生物素结

+底物，显色反应优点：链霉亲和素分子量较小，穿透力强；不含糖基链，等电点为6.5，接近中性(亲和素为10)，因此链霉亲和素几乎不与组织内的内源性凝集样物质发生非特异性结合，从而产生了低背景、高放大的效果2.链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术

（StreptAvidin-Biotin-Complex，SABC法）

3.标记生物素-抗生物素技术（Labelledavidin-biotinmethod，LAB技术）原理：+生物素标记的一抗

+HRP标记的抗生物素/亲和素特点：一个抗体分子可结合多个生物素分子，为其免疫活性不受影响，放大信号。

图2-12LAB法免疫细胞化学原理示意图

此法不如ABC法普及，但步骤较简便，有一定应用价值。

将亲和素和HRP直接耦合在一起。

4.链霉亲和素-过氧化物酶法

(streptavidin-peroxidase，SP)

20世纪90年代初，根据链霉亲和素-过氧化物酶连接系统设计的用于检测组织和细胞内抗原的一种高敏方法。实际为LAB法的间接标记法。原理：

+一抗（未标记的抗原特异性抗体）

+二抗（生物素标记的抗抗体）

+链霉亲和素-过氧化物酶复合物

特点：含有4个生物素（化二抗）结合位点，且两者间有极强的亲和力，放大信号。SP方法原理示意图SP方法原理示意图特点:

将SA和HRP直接耦合在一起，复合物分子量小（比ABC、SABC等），渗透组织能力强。ABC法原理示意图一抗生物素化二抗ABC复合物

比较：SABC法原理示意图一抗生物素化二抗SABC复合物（链霉亲和素-生物素-过氧化物酶）比较：

标记生物素-抗生物素技术（Labelledavidin-biotinmethod，LAB技术）直接标记法：

+一抗（生物素标记抗体）

+HRP标记抗生物素/亲和素图2-12LAB法免疫细胞化学原理示意图

比较：比较：

标记生物素-抗生物素技术（Labelledavidin-biotinmethod，LAB技术）SP（间接标记）法：+一抗（未标记）

+生物素化二抗

+HRP标记的链霉卵白素二抗优点：链霉亲和素仅标记过氧化物酶,并没有与生物素连接，故分子量较ABC复合物小，渗透组织的能力更强，反应速度更快，敏感性更高。链霉亲和素不含糖基链，不与组织内的含糖基类物质起反应，非特异性反应少。链霉亲和素等电点为6.5，接近中性，带负电荷少，不易与组织中正电荷吸引，背景染色低。缺点：

该放大系统含生物素，不适用于内源性生物素丰富的组织。？？？？

SP法优缺点

根据聚合物技术把HRP与抗鼠和(或)抗兔IgG分子结合在多聚肽上.

可避免生物素引起的非特异性背景反应

SP免疫细胞化学法显示胰岛β细胞

催化信号放大法（catalyzedsignalamplificationsystem，CSA法）

也称酪胺信号放大（TSA）原理：

酪胺的过氧化物酶反应(即HRP在H2O2存在下催化酪胺盐，形成共价结合位点)，产生大量的酶促产物；

酶促产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，在抗原抗体结合部位形成大量生物素沉积；再与加入的链霉亲和素—HRP结合。如经几次这样的循环放大，可以网络许许多多的酶分子，最后通过DAB的显色反应，其敏感性得到几何级放大。CSA

法

原

理

图CSA法优缺点优点：比EnVision法敏感20～100倍。适合于实验病理学和第一抗体昂贵（敏感，可稀释相当高）、抗原性较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法。核内抗原的检测（原为杂交）。缺点：操作步骤多、孵育时间长。存在严重的内源性干扰（内源性生物素、过氧化物酶、一抗与组织内的非特异性结合），背景染色有时较重。亲和组织化学中的亲和物质亲和素+生物素葡萄球菌A蛋白（SPA）+IgG植物凝集素+糖类阳离子+阴离子激素+受体…………..（二）葡萄球菌蛋白A技术

葡萄球菌蛋白A(StaphylococalproteinA,SPA),是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。

SPA特点：

可作为桥抗体或标记抗体，且不受种属特异性的限制。能与人及多种哺乳动物（如豚鼠、小鼠、猪、狗、猴等）血清中IgG的Fc段非特异性结合，而不影响抗体活性。SPA有双价结合力，可同时将酶、荧光素、胶体金等标记在SPA，用标记后的SPA可直接检测组织细胞内的IgG成分或免疫复合物。SPA分子量比酶标抗体小，尤其是比PAP复合物的分子量小得多，易于穿透组织，提高了敏感性。染色时间短、灵敏度高、背景染色淡。1.SPA-HRP间接法原理：HRP标记SPA，SPA能结合IgG（天然的抗IgG），代替IgG抗血清，从而测定组织中的IgG或免疫复合物。步骤：+一抗（未标记）

+SPA-HRP+底物，显色反应2.SPA-PAP法原理：SPA可结合IgG的Fc，因此可作为桥抗体，代替PAP复合物中的桥抗体。步骤：+一抗（未标记）

+SPA+PAP复合物（无种属限制，不要求与一抗相同种属动物制备）

+底物，显色反应特点：SPA与Fc、Fab的结合迅速，减少反应时间。敏感性不如PAP法，但背景染色低于PAP法。

反应前要先用H2O2、卵蛋白（蛋清）封闭。

PAP法原理图过量的二抗PAP复合物SPASPA亲和组织化学中的亲和物质亲和素+生物素葡萄球菌A蛋白（SPA）+IgG植物凝集素+糖类阳离子+阴离子激素+受体…………（三）凝集素组织化学技术

凝集素(lectin)是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。凝集素种类很多，常用的为植物凝集素，如：花生凝集素(PNA)、刀豆素A（ConA）等。共同特点：1）能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构;且具有特异性，即一种凝集素只能专一性结合某一种特异性糖基，如花生凝集素：D-半乳糖；刀豆素A：D-葡萄糖和D-甘露糖。2）凝集素具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金及铁蛋白等示踪物结合而不影响其生物活性，从而可作为组织化学探针在光镜、电镜水平显示其结合部位。常用的凝集素

即糖蛋白或糖脂中的寡糖，广泛分布于细胞衣、细胞膜、细胞内各种膜囊的游离面。这种受体在胚胎发育的不同阶段、细胞的不同分化程度、不同的代谢状态等都有不同程度的改变。因此，凝集素可作为研究细胞分化和成熟过程中细胞膜糖分子变化的理想工具。

凝集素受体凝集素在免疫细胞化学中的应用1.直接法

原理：将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞中相应糖蛋白或糖脂结合。

步骤：细胞膜上糖基

+PNA-HRP（或荧光等标记）

+底物，显色反应

优点：方法简便，但敏感性不够高。目前已有部分凝集素试剂盒供应。凝集素直接法染色(HRP-PNA)：显示不成熟B淋巴细胞

+间接酶标B220染色（