农作物组织培养

第八章

主要农作物的组织培养

以有性杂交为作为指导进行育种，这种方法局限性很大，而且周期长植物组织培养已广泛应用于植物育种，在单倍体育种、胚培养、体细胞杂交、细胞突变体筛选、遗传转化等方面离体无性系的快速繁殖培养无病毒种苗

新品种的选育人工种子和种质的保存。第一节农作物组织培养的意义、方法与应用

对繁殖系数低的“名、优、新、奇、特”植物品种的推广，兰花、安祖花、马蹄莲、甘薯、草莓、香蕉、甘蔗、桉树、非洲菊等经济植物已开始工厂化生产植物脱毒苗木培育

脱毒后的马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉等植物可大幅度提高产量，改善品质，兰花、水仙、大丽花等观赏植物脱毒后植株生长势强，花朵变大，产花量上升，色泽鲜艳植物新品种培育

基因工程育种（抗虫棉、抗除草剂大豆、玉米），单倍体育种-烟草单育1号、水稻“中花8号”、小麦“京花1号”，远缘杂交幼胚早期培养，原生质体融合技术，选择细胞突变体植物种质资源的离体保存

超低温离体保存植物种质，可节约大量的人力、物力和土地，还可挽救那些濒危物种

人工种子

为某些珍稀物种的繁殖以及转基因植物、自交不亲和植物、远缘杂种的繁殖提供有效的手段第二节棉花组织培养一、大量元素（20倍）母液(g/L)药品摩尔浓度（M/L）质量浓度（g/L）5L母液所需质量（g）备注KNO30.3838190

MgSO40.033.8/7.4(MgSO4·7H2O)19/37

KH2PO40.0253.417

CaCl20.066.6/8.8(CaCl2·2H2O)33/44单独溶解，最后加入二、微量元素（100倍）母液(g/L)

药品质量浓度(g/L)备注

5倍母液ⅠH3BO33.1加热助溶MnSO4·4H2O（或MnSO4·H2O）11.15（或8.45）

ZnSO4·7H2O4.3

20倍母液ⅡCoCl2·6H2O0.05

CuSO4·5H2O0.05单独溶解，最后加入KI1.66

NaMO4·2H2O0.5

微量元素二级母液（即我们平时配培养基时使用的微量）：取上述母液Ⅰ200ml，母液Ⅱ50ml，加蒸馏水定容至1L。铁盐母液配制（所用试剂均为国药产品）B5有机物配制（所用试剂均为sigma产品）药品摩尔浓度（M/L）质量浓度（g/L）备注FeSO4·7H2O0.012.78

Na2EDTA0.013.73加热助溶药品100ml所需质量（g）500ml所需质量（g）备注VB1（硫胺素）15

VB6（盐酸吡哆醇）0.10.5NaOH助溶VB3（烟酸）0.10.5NaOH助溶加入VB6和VB1后加部分水，再加入VB3，再次加水，容量瓶定容各种激素配制（所用试剂均为sigma产品）

质量浓度（g/L）备注2,4-D0.1无水乙醇助溶6-BA1

NAA1

L-Gly（甘氨酸）2国药产品肌醇10

IAA0.5

IBA0.5NaOH助溶KT0.5NaOH助溶/盐酸助溶*NH4NO3165国药产品愈伤组织的诱导

0.5-1cm的下胚轴切段接种于诱导培养基上，一个皿放25-30段下胚轴。一个月后挑选两端膨大，生长正常的下胚轴继代到新的IBA培养基上非胚性愈伤组织的增殖

由于愈伤组织的进一步膨大，一个皿中以20段下胚轴为宜愈伤组织的分化

愈伤组织经继代（一个月继代一次）几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上，进一步分化成胚状体成苗生根培养

将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上炼苗移栽

将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田棉花下胚轴组织培养过程棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的腺体处发生和外发生A1：下胚轴外植体；A2-A4：胚性愈伤组织在腺体处发生；B1：愈伤组织表面的胚性细胞；B2-B4：愈伤组织表面形成胚性组织棉花体细胞胚的单细胞起源和表面发生A：单细胞原胚、二细胞原胚和四细胞原胚(箭头所指)；B：具胚柄的多细胞原胚(箭头所指)；C：具胚柄的体胚；D-G：与愈伤组织粘连的体胚；H-I：游离的体胚棉花单个胚性细胞团培养中体细胞胚的发生和发育A：培养当天；B1-B2：培养7d；C1-C3：培养14d；D1-D3：培养21d后出现球形胚；E1-E3：心形胚阶段；F1-F3：鱼雷形胚阶段；G1-G3：子叶胚阶段棉花体细胞胚发育过程中的极性建立和组织分化A：球形胚表皮原形成；B：球形胚内层细胞分裂形成基础和维管组织；C：内部等轴细胞轴向延长形成的心形胚；D-E：极性的逐步建立和原形成细胞层的分化；F-G：具有清楚的前形成细胞层和极性的鱼雷形胚；H：具有子叶原基，芽顶端分生组织、前形成层和根顶端分生组织的鱼雷形胚；I：具有Y形微管组织的子叶胚棉花单个胚性细胞团培养中不同发育阶段的体细胞胚A1-A6：球形胚；B1-B6：心形胚；C1-C6：鱼雷形胚；D1-D6：子叶胚第三节水稻花药和花粉培养目录研究进展研究过程研究意义前景展望一研究进展1.水稻单倍体获得途径

花药培养、花粉培养胚珠或子房培养（未受精）概念：

单倍体育种：通过花药、花粉培养获得单倍体，然后进行染色体加倍，经过选择、鉴定选育出新品种的途径。花药培养：是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。

花粉培养：是将花粉从花药中分离出来,接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的过程。水稻花培历史：

▪1968年，日本人新关和大野首次通过水稻花药培养获得单倍体植株；

▪1970年，我国正式开展水稻花药培养技术研究，并取得良好进展；▪截至目前，已有多个品种通过花培途径获得。代表成果：天津农科院选育的花育“花育1号”、“花育2号”；中国农科院选育的中花系列；黑龙江农科院水稻所选育的龙粳系列品种。▪截至目前，通过花培选育出了很多粳稻品种并大面积的推广应用。1975-1998共审定26个品种。▪籼稻花药培养难度较大。至20世纪末，共有5个品种通过花培选育。二研究过程1.培养流程2.培养方法3.影响因素4.检测方法1.培养流程花药和花粉培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。选择合适的供体植株倍性鉴定或染色体加倍2.培养方法花药培养

1、取材镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。

3、培养固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。水稻花药培养由接种至长出愈伤图花粉培养与花药不同，花粉培养需进行花粉的分离与纯化及特殊的花粉诱导培养。分离和纯化方法1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)

将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。3、机械游离（1）磁搅拌法用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；（2）超速旋切法通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子小孢子梯度离心前后比较

梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）花粉培养方式1、平板培养花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。

4、看护培养

利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。3.影响因素（1）基因型

植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻，且在同一亚种范围内，不同品种间也存在很大差异。（2）培养基和激素配比选择

应用于水稻花培的基本培养基种类较多，如N6、马铃薯培养基、L8、SK3、土豆培养基、Miller、合5、通用、LS、White、MS、M8和改良M8等。同一材料用不同的培养基培养，表现出不同的花培效果。

培养基

三明市农科所生物技术中心以M8、N6和NB培养基，进行了不同水稻品种材料花培观察比较试验，结果从出愈率、绿苗分化率两者比较，还是M8培养基较适合。冯双华等用M8、合5和改良M8做基本培养基，以籼型杂交稻两优培九、培两优288、P88S/0293为材料，得出改良M8培养基表现出对不同的基因型材料有较广的适应性和较强的绿苗诱导作用。激素配比

生长素类一般有2,4-D、NAA、IAA等，细胞分裂素一般有6-BA、KT等。使用倾向：复合激素

冯双华等提出籼型材料用1.5mg/L2,4-D+1.5mg/LNAA诱导效果较好，2.0mg/L6-BA+0.25mg/LNAA+0.25mg/LIAA分化效果较好。

郭书巧等提出对籼粳交材料2mg/L2,4-D+1mg/LNAA+0.2mg/LKT为最佳的激素诱导配比，2.0mg/L6-BA+0.5mg/LKT分化效果较好。

结论：基因型不同，最适激素配比不同。一般认为，对籼型水稻采用复合激素较好。（3）田间取样与预处理

取样时间：晴天8:00~10:00，或16:00~18:00

取穗标准：：穗苞大而不破，剑叶与下一叶的叶枕距为5~10cm为宜

低温处理：一般认为5~8度条件下，低温预处理8~10d较好此外，还有其它处理方法：化学物质、射线、离心等。（4）培养条件温度、光照、密度4.检测方法1、染色体直接计数法

通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。（4）杂交鉴定法

自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标记鉴定

包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）三.研究意义1.缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而花培仅需一年。供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系2.提高了目标基因型的选择效率例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。

AB

aB

Ab

abAB

AABB AaBB AABb AaBbaB

aABB aaBB aABb aaBbAb

AabB AabB AAbb

Aabbab

aAbB aabB aAbb aabb2.提高了目标基因型的选择效率例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。

单倍体

二倍体

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->

AAbb ab---------------------------->

aabb供体亲本AaBb花培3.有利于隐性基因控制性状的选择4.与生物工程技术结合，对育种学及遗传基础研究都有很重要的意义。四.前景展望1.供体植物生长条件的进一步提高和离体培养方法的改进，有可能最终消除或大大减少花培药养基因型的限制。2.花药或小孢子培养体系做为基因转导的靶组织，可以实现稳定的转化，外源基因在后代中不易丢失或发生致命的突变，是很有前途的研究领域。

1999，美国洛克菲勒基金会的Toneeson在Science撰文指出，现代生物技术育种的两大支柱是基因工程育种和与分子标记相结合的加倍单倍体育种（DH育种），后者效率高，成本低，特别适合于发展中国家的国情。第四节玉米组织培养主要内容：植物组织培养的意义.玉米组织培养的目的.研究进展.目前玉米组织培养的主要方法.植物组织培养的意义植物组织培养可以生产大量的优良无性系.细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍.可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体.组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料.玉米组织培养的目的玉米组织培养的目的是让外植体能够高频率地诱导出愈伤组织，建立高效的体细胞再生体系，为玉米遗传转化和细胞工程研究创造有利条件。玉米组织培养的研究回顾Larue在1949年用甜玉米的胚乳作外植体，首次诱出玉米愈伤组织，但未获得再生植株。1975年，Green和Phillips首次用A188的幼胚作外植体，诱导出二倍体愈伤组织，并再生得到第一株无性系植株。玉米组织培养的研究现状现在已经能从多种外植体中诱导出愈伤组织，并再生出植株。例如：幼胚、花药、幼穗等，其中幼胚是最易诱导，也是目前最常用的外植体。玉米组织培养的主要方法（简介）1、玉米花粉和花药组织培养玉米花粉和花药的培养一般可获取单倍体植物，有利于促进玉米遗传育种工作的有效进展。2、玉米茎尖和根尖离体培养

玉米植株的根尖和茎尖分生组织具有良好的分化性能。玉米茎尖和根尖离体培养有利于促进完整玉米植株的生长,并且在取材上不受季节限制。3、玉米幼胚的组织培养玉米幼胚属于二倍体，且分生能力较强。幼胚是最易诱导，也是目前最常用的外植体，但幼胚取材的时间受到严格的季节限制。玉米幼胚组织培养的全过程1、准备工作接种室消毒准备诱导培养基（N6+肌醇+L-脯氨酸1.38g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D2mg/mL)灭菌2、外体消毒及挑幼胚75%酒精擦玉米外层叶片至超净工作台，用75%酒精擦玉米外层叶片，剥一层擦一层至完用刀去掉1/3玉米籽粒挑幼胚接种到准备好的诱导培养基上（暗培养）3、继代准备继代培养基(N6+水解酪蛋白0.1g/L+L-脯氨酸0.69g/L+甘露醇20g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+2,4-D1mg/ml)诱导两次后，转入继代培养基每7天继代一次，直至出透明、黄色、坚硬的愈伤组织，可用于转化（一般继代三次）4、转化侵染培养（22--25℃，暗培养3天）恢复培养（暗培养3天）筛选培养分化培养生根培养壮苗5、移栽及管理移栽前，应对移栽用的基质进行灭菌。移栽前，可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3天，然后再开口练苗1-2天，以适应将来自然湿度的条件。玉米组培苗移栽时首先应把根部的培养基清洗干净，以免受细菌或真菌污染而影响幼苗生长。移栽玉米茎尖组织培养的全过程1、准备工作接种室消毒准备培养基（MS+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L)灭菌1、玉米种子消毒在500ml三角瓶中装入200—300粒玉米种子用75%酒精清洗8min0.1%升汞5min无菌水洗2遍加入无菌水静置8h0.1%升汞8min无菌水洗5遍装入钣盒28℃暗培养3天2、接种取出培养三天后的种子，接种到MS固体培养基中，根向下伸入培养基中，芽向上，芽萌发得不太好的继续放进饭盒中再培养。接种到MS固体培养基中的芽放回28℃暗培养3-4天。3、玉米茎尖转化取出MS固体培养基中的芽放在无菌滤纸上切根镊子夹胚轴，在茎尖处用刀尖切半边。在茎尖生长点划一小口。转化后，接种于MS培养基中，进行暗培养。3、移栽及其管理

培养3—5天后，将其移栽至至花盆中，其中注意事项与前面的相同。后期的管理也于前者相近。

滨州职业学院第五节马铃薯的脱毒培养目的要求:

(1)掌握马铃薯脱毒培养的大致过程，了解马铃薯脱毒苗的鉴定方法;(2)掌握马铃薯的生物学习性：

(3)熟悉微型薯的生产过程滨州职业学院微型薯滨州职业学院滨州职业学院

马铃薯是一种全球性的重要经济作物。适应性广，营养价值高，耐贮藏适运输，既是一种重要的粮食作物也是一种调节市场供应的重要蔬菜。马铃薯原产于拉丁美洲，当被发现可以食用后，很快传到世界各地，成为栽培很广的一种作物。滨州职业学院但是，当发现从外地引种栽培1~2个周期后，明显发现产量降低，植株变矮，并有卷叶的现象产生，经检测证明这是由于病毒引起的退化现象。滨州职业学院

危害马铃薯的病毒有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。由于马铃薯是无性繁殖作物，病毒逐代积累，日益严重，引起严重退化。马铃薯病毒可使块茎产量减少50%~80%。滨州职业学院法国Morel和他的同事们，1955年从患病马铃薯植株中选取到了无病植株，为治疗作物病毒开辟了新途径。滨州职业学院一、特性和生物学习性1、马铃薯的形态特性根马铃薯的根系由初生根和匍匐根两部分组成。茎马铃薯分地上部分和地下部分，地上主茎在形成16片叶子后，由花芽封顶，并在花的下部发生两个侧枝，从而构成马铃薯的主要同化系统。地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎。滨州职业学院（3）叶马铃薯先出土的叶是初生叶，全缘，心脏形。以后发生的叶奇数羽状全裂单叶，在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶。（4）花马铃薯的花为聚伞花序，第一或第二花序开放，恰是块茎强盛膨大之时，此时是需要不断浇水的形态标志。

(5)果实、种子马铃薯果实为球形或椭圆形浆果。种子小。扁平肾形。种子可用来繁殖，但后代性状分离大。滨州职业学院2、生物学习性马铃薯性喜冷气候，不耐高温和霜冻，解除休眠的块茎4℃下发芽，发芽适温为12~18℃。地上茎叶生长温度为17~21℃，25℃以上时生长不良，叶变小，超过30℃和7℃以下茎叶停止生长，-1℃时受冻。块茎形成要求昼温14~24℃，夜温12~14℃，土温16~18℃。土温20℃以上时块茎形成缓慢，而且容易引起退化，高温下养分多用于芽和匍匐茎生长不易形成块茎，25~30℃时已经长成的块茎也变成细长茎，结薯期要求12h左右的短日照和疏松、湿润、肥沃以及通气良好的土壤条件。土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不整。滨州职业学院马铃薯生产中普遍存在有种性退化问题，表现为植株长势衰弱，株形矮化，分枝变少，薯块变小，产量逐降低，造成退化的原因和学说多种，综合而言，主要是薯块生长锥细胞发生阶段性衰老而导致种性退化，而病毒和细菌病害的侵染，以及肥水、营养条件不良等都会加剧其退化程度。滨州职业学院二、马铃薯脱毒技术马铃薯在营养繁殖时易受病毒的浸染，当条件适合时，病毒就会在植株内增殖，转运和积累，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般可造成减产50％以上。研究发现，有30多种病毒易感染马铃薯，并引起品种退化，严重影响马铃薯的生产。通过微茎尖组织培养技术能从马铃薯体内脱除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。滨州职业学院因此，采用组织培养技术，通过一定良种繁殖体系，生产优质种薯，是保证马铃薯高产、稳产的一项有效措施。滨州职业学院全国现有马铃薯播种面积300多万公顷，且有逐步增加的趋势，每年需合格种薯45亿公斤，脱毒原种4亿公斤，脱毒小薯或微型薯45亿粒。因此，脱毒马铃薯推广具有广阔的市场前景，对于增加农民收入和发展马铃薯产业化生产具有十分重要的意义。滨州职业学院我国的马铃薯平均单产仅为13.60吨/公顷，是世界单产最高国这瑞士（48.80吨/公顷）的1/4。造成如此大的差别，最主要的因素就是种薯质量差，品种布局不合理。采用脱毒快繁技术，种用脱毒种薯，一般可增产30-50%，甚至成倍增产，充分发挥品种的潜能，提高马铃薯生产能力。如果我国现有马铃薯播种面积的1/3（即114万公顷）用脱毒种薯，就可年增产粮食100多亿公斤。滨州职业学院我国在70年代用茎尖组织培养方法得到脱毒马铃薯试管苗，并成功地获得脱毒复壮的马铃薯，开始了脱毒种薯的生产和推广。"八五"期间，农业部在全国范围内设立了6个马铃薯原原种基地建设和种薯生产项目，初步形成了脱毒草种薯生产体系。共推广脱毒种薯36.5-40万公顷，获经济效益近30.8亿元。滨州职业学院我国已有许多科研、推广单位开展了脱毒马铃薯的研究和生产，在生产上产生了一定的经济效益和增产效果，但由于长期以来各自为政，技术方法和脱毒标准不尽统一，未能发挥出脱毒种薯应有的增产潜力。到目前为止，我国仍未建立国家级的脱毒种薯质量监督和病毒检测制度。

滨州职业学院1．脱毒种薯生产程序采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。滨州职业学院试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。用原原种在一定隔离条件下产生原种1代，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代。滨州职业学院滨州职业学院2．茎尖培养脱毒（1）取材和培养一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38℃）2周。然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗干净，无菌条件下先用70％的酒精浸润组织15-20秒，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡4--5min，然后用无菌水冲洗3次。滨州职业学院把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留1-2个叶原基，0.2—0.3毫米，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgNAA、0.2mgGA3、0.5mgBA，2%蔗糖，pH值5.8。培养条件：21~25℃、2000-3000lx、12h/d。2-3周愈伤，4-5周绿点，3--6月长成2-3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。（2）继代和生根培养成功的马铃薯脱毒苗，经ELISA（试剂盒）鉴定后（试管苗应每3月检测一次，每年4次）鉴定后，采用固体、液体培养基相结合方法扩繁。取试管苗单节切段扦插在（或平放）固体培养基上，每瓶可插20个左右茎段，经20d左右发育成5~10cm高小植株，继续进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5~8倍，试管苗多接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。滨州职业学院培养基：MS+NAA0.2-0.5+D-泛酸钙10，3%蔗糖，20-25度，3000-4000LX，14-16小时光照，