氨基酸工艺学课件

第五章氨基酸工艺学

1第一节概述1.1氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物——氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。也就是说，氨基酸发酵的关键，取决于其控制机制是否能被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为的控制微生物的代谢。氨基酸发酵的成功，把代谢控制发酵技术引入微生物工业，使微生物工业能在DNA分子水平上改变、控制微生物的代谢，使有用产品大量生成、积累。21.1.1氨基酸生产的历史1820年水解蛋白质开始1850年在实验室合成了氨基酸1866年（德）H.Ritthausen（立好生）博士利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材，称之为谷氨酸。1908年日本制造味之素。1909年用水解法生产谷氨酸。1936年（美）从甜菜废液（司蒂芬废液）中提谷氨酸。1954年多田、中山俩博士报告了直接发酵谷氨酸（L-GA）1957年发酵法生产味精商业性生产。

3从20世纪初期，氨基酸实现工业化生产以来，氨基酸生产大体有蛋内质水解法、化学合成法、微生物发酵法和酶法四种生产方法。蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸；化学合成法：DL-蛋氨酸、甘氨酸、DL-丙氨酸；酶法：L-丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸；微生物发酵法：生产60%以上的氨基酸，包括直接发酵法和添加前体发酵法。前三种方法成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产目的。4发酵法生产谷氨酸是现代发酵工业的重大创举，也是氨基酸生产的重大革命，同时大大推动了其它氨基酸研究和生产的发展。逐步形成了用发酵法制造氨基酸的新型发酵工业部门。生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。5我国从1958年开始筛选谷氨酸生产菌，同时进行了大量的谷氨酸发酵的基础性研究，1964年分离选育出北京棒状杆菌As1.299和钝齿杆菌As1.542二株谷氨酸生产菌。后进行其它的基础性研究，陆续发表了赖、缬、亮、异亮、色、天冬的发酵研究报告，建立了自己的发酵工业。6国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。2000年,世界氨基酸产值达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。71.2氨基酸发酵生产发展的历史回顾所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为培养基中的主要原料培养微生物,积累特定的氨基酸。这些方法成立的一个重要原因是使用选育好的氨基酸生物合成高能力的菌株。8菌株的育种

是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件.在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。91.2.1用用野野生生株株的的方方法法这是是从从自自然然界界获获得得的的分分离离菌菌株株进进行行发发酵酵生生产产的的一一种种方方法法。。典型型的的例例子子就就是是谷谷氨氨酸酸发发酵酵。。改变变培培养养条条件件的的发发酵酵转转换换法法中中,有有变变化化铵铵离离子子浓浓度度、、磷磷酸酸浓浓度度，，使使谷谷氨氨酸酸转转向向谷谷氨氨酰酰胺胺和和缬缬氨氨酸酸发发酵酵101.2.2用用营营养养缺缺陷陷变变异异株株的的方方法法这一一方方法法是是诱诱变变出出菌菌体体内内氨氨基基酸酸生生物物合合成成某某步步反反应应阻阻遏遏的的营营养养缺缺陷陷型型变变异异体体，，使使生生物物合合成成在在中中途途停停止止，，不不让让最最终终产产物物起起控控制制作作用用。。这种种方方法法中中有有用用高高丝丝氨氨酸酸缺缺陷陷株株的的赖赖氨氨酸酸发发酵酵，，有有用用精精氨氨酸酸缺缺陷陷株株的的鸟鸟氨氨酸酸发发酵酵，，还还有有用用异异亮亮氨氨酸酸缺缺陷陷株株的的脯脯氨氨酸酸发发酵酵。。11谷氨氨酸酸棒棒状状杆杆菌菌的的苏苏氨氨酸酸、、异异亮亮氨氨酸酸、、甲甲硫硫氨氨酸酸和和赖赖氨氨酸酸的的合合成成是是与与分分枝枝途途径径相相联联系系的的(图图4-8)，，筛筛选选高高丝丝氨氨酸酸营营养养缺缺陷陷型型后后，，限限量量供供给给苏苏氨氨酸酸时时，，就就能能解解除除由由苏苏氨氨酸酸和和赖赖氨氨酸酸的的协协同同反反馈馈抑抑制制作作用用，，而而获获得得赖赖氨氨酸酸的的过过量量生生产产。。这这是是因因为为仅仅有有赖赖氨氨酸酸或或苏苏氨氨酸酸存存在在时时，，天天冬冬氨氨酸酸激激酶酶不不被被抑抑制制，，只只有有两两者者的的协协同同效效应应才才能能造造成成抑抑制制。。在在限限量量供供给给苏苏氨氨酸酸的的情情况况下下，，即即使使赖赖氨氨酸酸过过剩剩，，抑抑制制作作用用也也很很难难发发生生。。121.2.3类似物物抗性变异异株的方法法用一种与自自己想获得得的氨基酸酸结构相类类似的化合合物加入培培养基内，，使其发生生控制作用用，从而抑抑制微生物物的生长。。这样，就就可以得到到在这种培培养基中能能够生长的的变异株，，而这种变变异株正是是解除了调调控机制的的，能够生生成过量的的氨基酸。。利用此方法法发酵的有有:苏氨酸酸、赖氨酸酸、异亮氨氨酸、组氨氨酸和精氨氨酸。13高丝氨酸脱脱氢酶例如，在黄黄色短杆菌菌的赖氨酸酸、苏氨酸酸和异亮氨氨酸生物合合成中（图图5-16所示），，选育抗苏苏氨酸结构构类似物2-氨基-3-羟基基戊酸（AHVr）突变株，，得到了具具有反馈抑抑制抗性，，高丝氨酸酸脱氢酶活活性提高1300倍倍，能积累累14g/L苏氨酸酸的突变株株。141.2.4体内内及体外基基因重组的的方法基因工程包包括细胞内内基因重组组方法和试试管内的体体外基因重重组方法。。体内基因重重组在应用用上又称为为杂交育种种，主要方方法包括：：转化、转转染、接合合转移、转转导和细胞胞融合等，，这都是在在细胞内暂暂时地产生生染色体的的局部二倍倍体，在两两条DNA链之间引引起两次以以上的交叉叉，是遗传传性重组现现象。细胞内基因因重组技术术的缺点是是，现在只只在同种或或有近缘关关系的微生生物之间进进行并较难难成功。15代谢工程在在阐明代谢谢途径及其其调控规律律的基础上上，应用重重组DNA技术可以以改变代谢谢途径分支支点上的流流量或引入入新的代谢谢步骤与构构建新的代代谢网络。。其主要步骤骤为:鉴定目标代代谢途径涉涉及的酶(特别是限限速酶);取得酶基因因，必要时时可用蛋白白质工程技技术，如定定点诱变，，基因剪接接等，使蛋蛋白具有新新的特点(增强活性性或稳定性性、解除反反馈抑制等等);将一种或多多种异源的的或改造后后的酶基因因与调节元元件一起克克隆进目标标生物;使调节元件件的作用及及培育条件件最优化。。通过基因工工程技术，，构建理想想的工程菌菌株1.2.5基因工程程菌161.2.5.1载载体-受体体系统及克克隆表达的的研究1.2.5.1.1受体的的获得目前使用的的氨基酸工工程菌受体体主要是大大肠杆菌K-12及及棒状杆菌菌家族，通通常是通过过诱变选育育出的基础础产率较高高的菌株。。大肠杆菌遗遗传背景研研究得清楚楚，载体系系统完善，，利于工程程菌的构建建，但它含含有内毒素素且不能将将蛋白产物物分泌至胞胞外，为应应用带来困困难。棒状杆菌能能克服这两两个缺点，，但载体受受体系统研研究较晚且且有限制修修饰系统的的障碍，所所以获得利利于外源基基因导入及及表达且能能稳定遗传传的受体菌菌是尚待解解决的问题题。171.2.5.1.2载体的的构建有效的载体体需要有在在受体菌中中可启动的的复制起始始位点，这这可从棒状状杆菌家族族内源小质质粒中获得得;载体所需的的筛选标记记及外源基基因插入的的多克隆位位点，可从从常用的克克隆载体中中获得。181.2.5.1.3基因转转移手段由于棒状杆杆菌是革兰兰氏阳性菌菌，CaCl2转化化法对它不不适用。通常采用的的方法有:原生质体体转化、转转导，电转转化，接合合转移。原生质体转转化的方法法是较早采采用的方法法，由于受受到原生质质体再生条条件的局限限，效率不不高;电转化方法法由于高效效，快速被被广泛使用用，目前它它的转化效效率可达到到原生质体体转化法的的100～～1000倍。接合转移可可用于基因因在亲缘关关系远的物物种之间的的转移，并并且可将外外源基因整整合于染色色体上，易易于稳定遗遗传。191.3氨基基酸发酵的的代谢控制制是氨基酸代代谢控制发发酵的基本本策略之二二菌种的代谢谢调控:控制发酵的的条件控制细胞渗渗透性控制旁路代代谢降低反馈作作用物的浓浓度消除终产物物的反馈抑抑制与阻遏遏作用促进ATP的积累，，以利氨基基酸的生物物合成201、控制发发酵环境条条件专性需氧菌菌，控制环环境条件可可改变代谢谢途径和产产物。212、控制细细胞渗透性性生物素、油油酸和表面面活性剂，，引起细胞胞膜的脂肪肪酸成分的的改变。细胞内生物物素水平高高，Glu不能通过过细胞膜青霉素：抑抑制细胞壁壁的合成，，由于细胞胞面内外的的渗透压而而泄露出来来。表面活性剂剂增加细胞胞膜通透性性氨基酸发酵酵必须考虑虑的重要因因素22细胞透性的的调节细胞透性的的调节，一一般通过向向培养基中中添加化学学成分（如如生物素、、油酸、甘甘油、表面面活性剂、、青霉素等等，达到抑抑制磷脂、、细胞膜的的形成或阻阻碍细胞壁壁的正常生生物合成，，使谷氨酸酸生产菌处处于异常生生理状态，，解除细胞胞对谷氨酸酸向胞外漏漏出的渗透透障碍。生物素：影影响磷脂的的合成及细细胞膜的完完整性。油酸：直接接影响磷脂脂的合成及及细胞膜甘油：甘油油缺陷型菌菌株丧失α-磷酸甘甘油脱氢酶酶，不能合合成α-磷磷酸甘油和和磷脂。限量供应，，控制了了细胞膜中中与渗透性性直接关系系的磷脂含含量，使谷谷氨酸排出出胞外而积积累。表面活性剂剂：对生物物素有拮抗抗作用，拮拮抗不饱和和脂肪酸的的合成，导导致磷脂合合成不足，，影响细胞胞膜的完整整性，提供供细胞膜对对谷氨酸的的渗透性。。青霉素：：抑制细细菌细胞胞壁的后后期合成成，形成成不完整整的细胞胞壁，使使细胞膜膜失去保保护，使使胞内外外的渗透透压差导导致细胞胞膜的物物理损伤伤，增大大谷氨酸酸向胞外外漏出的的渗透性性23生物素阻断脂肪肪酸的合合成影响细胞胞膜的合合成表面活性性剂对生物素素有拮抗抗阻断脂肪肪酸的合合成影响细胞胞膜的合合成在对数生生长期添添加青霉霉素抑制细胞胞壁合成成细胞膜损损伤甘油缺陷陷型磷脂的合合成受阻阻影响细胞胞膜的合合成油酸缺陷陷型阻断不饱饱和脂肪肪酸的合合成影响细胞胞膜的合合成提高细胞胞膜的谷氨酸通通透性控制磷脂脂的合成成使细胞膜膜受损（（如表面面活性剂剂）青霉素损损伤细胞胞壁，间间接影响响细胞膜膜控制磷脂脂含量通过油酸酸的合成成通过甘油油合成直接控制制磷脂合合成243、控制制旁路代代谢254、降低低反馈作作用物的的浓度利用营养养缺陷型型突变株株进行氨氨基酸发发酵必须须限制所所要求的的氨基酸酸的量。。限制瓜氨氨酸的浓浓度可解解除反馈馈抑制，，实现鸟鸟氨酸的的生物合合成。265、消除除终产物物的反馈馈抑制与与阻遏作作用使用抗氨氨基酸结结构类似似物突变变株的方方法或者者通过选选育营养养缺陷型型菌株。。6、促进进ATP的积累累，以利利氨基酸酸的生物物合成ATP的的积累可可促进氨氨基酸的的生物合合成27迄今，日日已有22种氨氨基酸可可用发酵酵法生产产。但生产上上不一定定非用生生物合成成。根据据经济、、资源的的合理性性，利用用不同方方法生产产氨基酸酸。如蛋蛋氨酸、、鸟氨酸酸用化学学合成法法，胱氨氨酸可用用提取法法水解。。但化学学合成为为D型，，右旋。。生物合合成为L型，左左旋。水水解法污污染厉害害。因而而总的来来说，氨氨基酸生生产要用用生物合合成。28今后的发发展是育育出从遗遗传角度度解除了了反馈调调节和遗遗传性稳稳定的更更理想菌菌种。提提高产酸酸。采用用过程控控制，加加强种子子管理、、连续化化、自动动化、稳稳产高产产、探索索新工艺艺、新设设备，以以提高产产率和收收得率、、研究微微生物生生理、生生化、遗遗传变异异和发酵酵机制等等问题，，以便能能更好地地控制氨氨基酸这这样微生生物中间间代谢产产物的发发酵。29二、氨基基酸的应应用（一）医医药因为蛋白白质是由由各种氨氨基酸构构成的，，所以各各种氨基基酸及其其衍生物物可治疗疗各种不不同的疾疾病。如消化系系统经手手术后，，或烧伤伤、创伤伤病例需需大量补补充蛋白白质营养养时，可可注射各各种氨基基酸，配配比接近近鸡蛋的的配比为为佳。八八种必须须氨基酸酸（异亮亮氨酸、、亮氨酸酸、赖氨氨酸、苯苯丙氨酸酸、蛋氨氨酸、色色氨酸））苯丙氨酸酸与氮芥芥子气合合成的苯苯丙氨酸酸氮芥子子气对骨骨髓肿瘤瘤治疗有有效,且且副作用用低。30（二）食食品1．调味味用的氨氨基酸①味精（（Glu-Na）其与肌苷苷酸钠或或鸟苷酸酸钠同时时使用，，具协同同作用，，可提高高鲜味。。②天冬氨氨酸钠用量仅次次于味精精的调味味品，具具强烈鲜鲜味。③甘氨酸酸甜味为砂砂糖的0.8倍倍。在果果汁中加加0.02%～～0.4%的甘甘氨酸，，可去除除糖精的的苦味。。31④DL-丙氨酸酸。甜味味为砂糖糖的1.2倍。。⑤D-色色氨酸。。甜味为为砂糖的的35倍倍。用于于牙膏、、糖尿病病人及肥肥胖病人人。⑥天冬氨氨酸-苯苯丙氨酸酸甲酯。。甜味为为砂糖的的150倍。但但其水溶溶液不耐耐热，70～80℃就就分解，，加热至至100℃就失失去甜味味。2．提高高食品的的营养价价值。8种人体体必须氨氨基酸，，不能在在体内合合成，而而各种食食品又缺缺乏某一一特定的的必须氨氨基酸，，添加之之可提高高蛋白质质的利用用率。如如。鱼缺缺色氨酸酸。强化食品品(赖氨氨酸，苏苏氨酸，，色氨酸酸于小麦麦中)32（三）农农业1．增加加饲料的的营养率率。如，谷类类缺赖氨氨酸，豆豆类缺蛋蛋氨酸。。甲硫氨酸酸等必需需氨基酸酸可用于于制造动动物饲料料。2．氨基基酸农药药如，水稻稻孕穗期期使用氨氨基酸脂脂肪酸农农药N-月桂酰酰-L-异戊氨氨酸能防防止稻瘟瘟病，提提高水稻稻蛋白质质的含量量，改进进稻米的的风味和和品质。。33（四）工工业原料料1．人造造革D-谷氨氨酸聚合合生成聚聚合谷氨氨酸（PLG））2．洗涤涤剂十二烷酰酰基谷氨氨酸（AGS））肥皂以以及用月月桂酰氨氨与D/L-GA制成成的肥皂皂，其洗洗净力，，起泡力力，乳化化力，分分散力均均好。3．润肤肤剂（焦谷氨氨酸钠））脱一分分子水形形成NPCA-Na。。保湿性性比甘油油好。34请写出从从葡萄糖糖到谷氨氨酸的合合成途径径，并说说明与合合成效率率有关的的机制35第二节谷谷氨氨酸发酵酵机制一、工艺艺过程谷氨酸发发酵工艺艺流程36等电点提提取谷氨氨酸工艺艺流程37谷氨酸制制味精的的工艺流流程3839国内用糖糖蜜发酵酵，要加加吐温（（表面活活性剂））国外用糖糖蜜发酵酵，日本本加青霉霉素，法法国不用用青霉素素、吐温温、是由由其菌特特点所决决定Glu生生长水平平好坏有有关因素素：菌种、工工艺、设设备条件件协同配配和正常条件件下，菌菌体产生生Glu在发酵酵液中为为1mg/ml(1％％)谷氨酸代代谢调节节，细胞胞膜透性性调节与与环境条条件协同同配和。。40第二节谷谷氨酸酸生物和和成途径径代谢控制制发酵是是用遗传传学或其其他生物物化学的的方法，，人为地在分子子水平上上改变和和控制微微生物的的代谢，，打破微微生物正常常的代谢谢调节，，使有用用产物大大量生成成和积累累。氨基酸发发酵是典典型的代代谢控制制发酵，，发酵技技术的关关键是打打破微生生物的正正常代谢谢调节，，人为控控制微生生物的代代谢。葡萄糖经经糖酵解解(EMP途径径)和己己糖磷酸酸支路(HMP途径)生成丙丙酮酸，，再氧化化成乙乙酰CoA，然然后进入入三羧酸酸循环，，再通过过乙醛酸酸循环、、CO2固定作用用，生成成α-酮酮戊二酸酸，α-酮戊二二酸在谷谷氨酸脱脱氢酶的的催化及及有NH4+存在的条条件下，，生成谷谷氨酸。。41由葡萄糖糖生物合合成谷氨氨酸42二、氨氨的导导入还原氨基基化反应应（GDH））转氨反应应（AT）谷氨酸合合成酶（（GS））催化的的反应431、谷氨氨酸生物物合成中中的几个个途径（（正常途途径）（1）糖糖酵解途途径（（EMP））（2）磷磷酸已糖糖途径（（HMP)（3）三三羧酸循循环(TCA环环)（4）乙乙醛酸循循环（（DCA环环）（5）二二氧化碳碳固定反反应PEP+CO2+GTP草草酰乙酸+GDP丙酮酸+CO2+NADH苹苹果酸+NAD草草酰乙酸CO2NAD+NADH+H+（6）α-KGA的还原原氨基化反应应PEP羧化酶酶苹果酸酶苹果酸脱氢酶酶C6H12O6+NH3+O2→C5H9O4N+CO2+3H2O在GA产生菌菌菌体内CO2固定反应应有以下两条条途径：44①苹果酸酶②丙酮酸羧化化酶③磷酸烯醇丙丙酮酸羧化酶CO2固定反反应(丙酮酸酸羧化支路)452、GA生物物合成的理想想途径（1）GA产产生菌必须具具备以下条件件（内在因素素）α-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺失TCA环阻断，α-酮戊二酸积累琥珀酸辅酶ATCA环正常

GA产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失积累NADPH，抑制α—KGA的脱羧氧化46

GA产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA发酵积累菌体有强烈的的L—谷氨酸酸脱氢酶活性性α—KGA+NH4++NADPH==GA+NADP提供NADPH,用于还还原α-酮戊二酸酸生成谷氨酸酸，形成氧化化还原共扼体体系该反应的关键键是与异柠檬檬酸脱羧氧化化相偶联473/2GlucoseEMP丙酮酮酸+丙丙酮酸+丙丙酮酸乙酰辅酶A+乙酰辅酶A+乙酰辅辅酶A柠檬酸则有：3/2C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+4CO2产率：147/（180*3/2）==54.4%CO2谷氨酸在前述GA合合成所必需需的条件的基基础上，体系系不存在CO2固定反应应，则有：体系存在CO2的固定反应结论通过DCA环环提供C4二二羧酸时谷氨氨酸对糖的转转化率仅为54.4%在谷氨酸发酵酵中，DCA环可以作为为TCA循环环有缺陷时C4二羧酸的的补充48.在前述GA合成所必必需的条件的的基础上（封封闭乙醛酸循循环）存在CO2固定反反应，则有：：GlucoseEMP丙丙酮酸+丙丙酮酸CO2则有：C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+CO2（来自何方））产率：147/180==81.7%乙酰辅酶A+C4二羧酸CO2草酰乙酸（草草酰乙酸羧化化酶）苹果酸（苹果果酸激酶）柠檬酸（DCA循环封闭闭）谷氨酸49四碳二羧酸酸的来源Δ在生产菌菌中检出CO2固定反应酶酶活性磷酸烯醇丙丙酮酸(PEF)羧羧化酶和苹苹果酸酶谷氨酸对糖糖的转化率率达到81.7%C6H12O6+NH3+1.5O2──C5H9O4N+CO2+3H2O需要Mn2+做催化化剂，所以以，在GA发酵过程程中需要向向培养基中中补充Mn2+实际上，发发酵过程中中不可能控控制柠檬酸酸合成所需需的C4二二羧酸完全全来自于CO2固定定反应，体体系也不可可能完全不不存在CO2固定反反应，因此此，GA发发酵的糖糖酸转化率率应在：54.4%——81.7%。。目前，国国内的GA生产企业业的糖酸转转化率通常常都在50%以内：：50提高GA的的潜力是很很大的，具具体表现在在：（1）强化化CO2固定反应，，具体措施施：Mn2+，生物素，，（2）控制制溶氧浓度度是非常重重要的低的溶氧浓浓度，则丙丙酮酸向乳乳酸方向转转化……高的溶氧浓浓度，则NADPH有被氧氧化的可能能，……51氨的导入①还原氨氨基化反应应为主导性性反应由谷氨酸脱脱氢酶（GDH）所所催化②转氨氨酶（AT）催化的的转氨反应应利用已存在在的其他氨氨基酸，经经过转氨酶酶的作用，，将其它氨氨基酸与生成L-谷谷氨酸③谷氨酸酸合成酶（（GS）催催化的反应应以-酮戊二酸酸为基质不不能生成Glu，从从此可看出出H2来自52氨的导入合成谷氨酸酸的反应有有3种：α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶AT谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶GSα-酮戊二酸NH4+NADPH谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脱氢酶GHD+++53（2）影响响谷氨酸合合成的外在在因素a、生物素素对糖代谢谢的影响生物素参与与糖代谢作作用：增加糖代谢谢的速度(对TCA有促进作作用）乳酸积累碳源利用率率降低，发发酵液的pH值下降降。而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累A、生物素素对GA发发酵的影响响主要影响糖糖降解速度度，不影响响EMP与与HMP途途径的比率率。生物素素充足的条条件下，丙丙酮酸以后后的氧化活活性虽然也也得到提高高，但由于于糖降解速速度显著提提高，打破破了糖降解解速度与丙丙酮酸氧化化速度之间间的平衡，，丙酮酸趋趋于生成乳乳酸的反应应，引起乳乳酸的溢出出。5455研究表明，异柠檬酸裂解酶活性

为醋酸诱导

受琥珀酸的阻遏，抑制当VH缺乏时：（1）丙酮酮酸的有氧氧氧化就会会减弱，则则：乙酰辅辅酶A的生生成量就会会少，醋酸酸浓度降低低，它的诱诱导作用降降低；通过过控制生物物素亚适量量，几乎看看不到异柠柠檬酸裂解解酶的活性性（2）VH对TCA循循环的促进进作用的降降低，使得得其中间产产物琥珀酸酸的氧化速速度降低，，其浓度得得到积累，，这样它的的阻遏和抑抑制作用加加强；乙醛醛酸循环基基本上是封封闭的，代代谢流向异异柠檬酸→→α-酮戊戊二酸→谷谷氨酸的方方向高效率率地移动两者综合的的作用使得得，异柠檬檬酸裂解酶酶的活性丧丧失，DCA循环得得到封闭。。b、控制VH的浓度，以以实现对于于乙醛酸循循环的封闭闭56c、生物素素对氮代谢谢的影响VH丰富时，出出现“只长菌，不不产酸”的现象GA发酵过过程中，前前期，菌体体的增殖期期，一定的的量的生物物素是菌体体增殖所必必需的；而而在产物合合成期，则则要限制生生物素的浓浓度，以保保证产物的的正常合成成。结论氨的导入时时生物素缺乏乏，NH4+影响糖代谢谢速度：提提高糖代谢谢速度高效合成谷谷氨酸生物素充足足时，NH4+不影响糖代代谢速度57关于氮代谢谢的调节：：控制谷氨酸酸发酵的关关键之一就就是降低蛋蛋白质的合合成能力，，使合成的的谷氨酸不不能转化成成其他氨基基酸或参与与蛋白质合合成。在生物素亚亚适量的情情况下，几几乎没有异异柠檬酸裂裂解酶，琥琥珀酸氧化化能力弱，，苹果酸和和草酰乙酸酸脱羧反应应停滞，在在铵离子适适量存在下下，生成积积累谷氨酸酸。生成的的谷氨酸也也不通过转转氨作用生生成其他氨氨基酸和合合成蛋白质质。在生物素充充足的条件件下，异柠柠檬酸裂解解酶活性增增强，琥珀珀酸氧化能能力增强，，丙酮酸氧氧化力加强强，乙醛酸酸循环的比比例增加，，草酰乙酸酸、苹果酸酸脱羧反应应增强，蛋蛋白质合成成增强，谷谷氨酸减少少，合成的的谷氨酸通通过转氨作作用生成的的其他氨基基酸量增加加。58d、VH对菌体细胞胞膜通透性性的影响通常谷氨酸酸发酵采用用的菌种都都是VH-，而VH又是菌体细细胞膜合成成的必须物物质，因此此，可以通通过控制VH的浓度（干扰磷脂中中的脂肪酸酸的生物合合成）来实现的来来实现对菌菌体细胞膜膜通透性的的调节。。葡萄糖丙酮酸+丙酮酸乙酰辅酶A乙酰辅酶ＡＡ乙酰辅酶A羧化酶（辅酶是VH）CO2丙二二酰酰辅辅酶酶A丙二酰辅辅酶AC4C6CO2培养基中中生物素素限量时时，胞内内AA92%胞外培养基中中生物素素丰富时时，胞内内AA12%胞外CO259Glu生生产菌大大多是生生物素缺缺陷型，，发酵时时控制生生物素亚亚适量，使细细胞变形形拉长，，改变了了细胞膜膜的通透透性引起起代谢失失调使Glu得以以积累。。生物素贫贫乏时，，细胞内内的Glu含量量少而且且容易析析出，而而培养基中积积累大量量的Glu；生生物素丰丰富时，，培养基基中几乎乎不积累Glu，而而细胞内内却含有有大量的的Glu，且不不易被析析出。这说明生生物素对对细胞膜膜通透性性有重要要影响。。谷氨酸发发酵的关关键在于于发酵培培养期间间谷氨酸酸生产菌菌细胞膜膜结构与与功能发发生特异异性变化化，使细细胞膜转转变成有有利于谷谷氨酸向向膜外渗渗透的形形态，使使终产物物不断排排出细胞胞外，胞胞内谷氨氨酸不能能积累到到引起反反馈调节节的浓度度，胞内内谷氨酸酸源源不不断被优优先合成成，分泌泌到发酵酵培养基基中积累累。60B、供氧氧浓度过量：NADPH的再再氧化能能力会加加强，使使α-KGA的的还原氨氨基化受受到影响响，不利利于GA的生生成。供氧不足足：积累大量量的乳酸酸，使发发酵液的的pH值值下降，，不利于于GA的的产生，，同时，，一部分分葡萄糖糖转成了了乳酸，，影响了了糖酸转转化率，，降低了了产物的的提出率率。C、NH4+浓度（1）影影响到发发酵液的的pH值值（2）与与产物的的形成有有关：过低，不不利于αα-KGA的还还原氨基基化；过过高，产产生谷氨氨酰胺。。NH4+的供给给方式：：（1）液液氨（2）流流加尿素素61D、磷酸酸盐过量：（（1）促促进EMP途径径，打破破EMP与TCA之间间的的平衡，，积累丙丙酮酸，，产生乳乳酸等………（2）产产生并积积累Val，Glucose丙酮酸丙酮酸+活性乙醛α-乙酰乳酸ValVal（1）可可以抑制制葡萄糖糖丙丙酮酮酸，使使GA的的生物合合成受到到阻止（2）消消耗了丙丙酮酸，，降低了了糖酸转转化率（3）发酵液液中的Val存在，严严重的影影响GA的结晶、、提出62研究证明明：谷氨酸生生产菌种种存在EMP途途径的全全部酶和和HMP途径的的酶酶有关TCA循循环中的的柠檬酸酸、顺乌乌头酸、、异柠檬檬酸能定定量地生生成谷氨酸酸，其相相应的酶酶与谷氨氨酸合成成有关以醋酸和和乙醇为为原料进进行谷氨氨酸发酵酵时，DCA循循环是C4二羧酸的的唯一补补充来源源；但是是以葡萄萄糖为原原料时，，在谷氨酸生成成期此循循环应关关闭谷氨酸菌菌存在CO2固定生成成草酰乙乙酸的PEP羧羧化酶和和苹果酸酶，与与谷氨酸酸得率正正相关63一.控控制细胞胞膜透性性的方法法1.化化学控制制方法通过控制制发酵培培养基中中的化学学成分,达到控控制磷脂脂,细胞胞膜的形形成或阻阻碍细胞胞壁正常常的生物物合成,使谷氨氨酸生产产菌处于于异常的的生理状状态,以以解除细细胞对谷谷氨酸向向胞外漏漏出的渗渗透障碍碍。64①控制制磷脂的的合成,导致形形成磷脂脂合成不不足的不不完全的的细胞膜膜(1)生生物素素缺陷型型使用生物物素缺陷陷型菌株株进行谷谷氨酸发发酵时,必须限限制发酵酵培养基基中生物物素的浓浓度.a.作作用机制制:生物素作作为催化化脂肪酸酸生物合合成最初初反应的的关键酶酶乙酰CoA羧羧化酶的的辅酶,参与了了脂肪酸酸的合成成,进而而影响磷磷脂的合合成.当当磷脂合合成减少少到正常常量的1/2左左右时,细胞变变形、谷谷氨酸向向膜外漏漏出,积积累于发发酵液中中。65b.控控制的关关键为了形成成有利于于谷氨酸酸向外渗渗透的磷磷脂合成成不足的的细胞膜膜,必须须亚适量量控制生生物素(5-10ug/l)发酵初初期(0-8h)菌体体正常生生长,菌菌体形态态为单个个成对对八字字形棒棒形椭椭圆短短杆形,当生物物素耗尽尽后,在在菌的再再次倍增增期间,开始出出现异常常形态的的细胞,菌体伸伸长,膨膨大乃至至不规则则形,边边缘有折折绉,稍稍模糊电电镜观察察似疱疹疹样，完完成谷氨氨酸非积积累型细细胞向积积累型细细胞的转转变,形形成磷脂脂合成不不足的不不完全的的细胞膜膜.谷氨氨酸高产产。若生生物素过过剩,就就会只长长菌不产产酸或长长菌好产产酸低。。66(2)添添加加表面活活性剂(如吐温温60)或是饱饱和脂肪肪酸(C16-18)使用生物物素过量量的糖蜜蜜原料发发酵生产产谷氨酸酸时通过过添加表表面活性性剂(吐吐温60)或高高级饱和和脂肪酸酸(C16-18)及及其亲水水聚酸脂脂类,同同样能清清除渗透透障碍物物，积累谷氨氨酸a.作作用机制制表面活性性剂、高级饱和和脂肪酸酸的作用用,并不不在于它它的表面面效果,而是在在不饱和和脂肪酸酸的合成成过程中中,作为为抗代谢谢物具有有抑制作作用,对对生物素素有拮抗抗作用,通过拮拮抗脂肪肪酸的生生物合成成导致磷磷脂合成成不足,结果形形成磷脂脂不足的的细胞膜膜,提高高了细胞胞膜对谷谷氨酸的的渗透性性67b.影影响产酸酸的关键键,必须须控制好好添加表表面活性性剂.饱饱和脂肪肪酸的时时间与浓浓度,必必须在药药剂添加加后.在在这些药药剂存在在下,再再次进行行细菌的的分裂繁繁殖.形形成处于于异常生生理状态态的产酸酸型细胞胞,即完完成谷氨氨酸非积积累型细细胞向谷谷氨酸积积累型细细胞的转转变.例例如,以以甜菜糖糖蜜为原原料,采采用高生生物素高高吐温温工艺。。一般于于发酵对对数生长长期的早早期(4-6h),添添加0.2％吐吐温60，之后后OD值值与菌体体重约净净种增一一倍,剩剩余生长长太多,意味着着谷氨酸酸生产菌菌细胞不不能完成成有效的的生理学学变化，，剩余生生长不足足,意味味着谷氨氨酸生产产菌没有有机会完完成这种种转变.68(3)油油酸酸缺陷使用油酸酸缺陷型型菌株进进行谷氨氨酸发酵酵时,必必须限制制发酵培培养基中中油酸的的浓度，，由于油油酸缺陷陷型突变变株切断断了油酸酸的后期期合成,丧失了了自身合合成油酸酸的能力力69(4)甘甘油缺陷陷型使用甘油油缺陷型型菌株进进行谷氨氨酸发酵酵时,必必须限制制发酵培培养基中中甘油的的浓度②阻碍谷谷氨酸生生产菌细细胞壁的的合成作用机制制:添加加青霉素素是抑制制谷氨酸酸生产菌菌细胞壁壁的后期期合成，，进而导导致形成成不完全全的细胞胞膜。影响产产酸关关键：：702、物物理控控制方方法：：利用温温度敏敏感突突变株株突变位位置：：发生生在决决定与与谷氨氨酸分分泌有有密切切关系系的细细胞膜膜结构构的基基因上上，发发生碱碱基的的转换换或颠颠换，，一个个碱基基为另另一个个碱基基所置置换，，这样样为基基因所所指导导译出出的酶酶，在在高温温时失失活，，导致致细胞胞膜某某些结结构的的改变变。影响产产酸关关键：：控制制温度度转换换的时时间（（30℃提提高到到40℃℃的的时间间），，并要要在温温度转转换之之后进进行适适度的的剩余余生长长。71第四节节GA生生产菌菌的特特征育育种及及扩大大培养养一、谷谷氨酸酸生产产菌的的主要要特征征与菌菌学性性质1.现现有谷谷氨酸酸生产产主要要是四四个属属短杆菌菌科短短杆菌菌属(Brevibacteriaceea)(Brevibacterium)1.棒棒状杆杆菌属属(Corgnebacferium)棒杆菌菌科2.小小杆菌菌属(Microbacterium)(Corgnebacteriaceae)3.节杆杆菌(Arthrobacter)722.现现有有谷氨氨酸生生产菌菌的主主要特特征这些菌菌曾分分属四四个属属,但但它们们在形形态及及生理理方面面仍有有许多多共同同的特特征（1））细胞胞形态态为球球形、、棒棒形以以至短短杆形形（2））G+无芽孢孢，无无鞭鞭毛,不能能运动动（3））都是是需氧氧型微微生物物（4））都是是生物物素缺缺陷型型（5））脲酶酶强阳阳性（6））不分分解淀淀粉、、纤纤维素素、油油脂脂、、酪蛋蛋白及及明胶胶等73（7））发酵酵中菌菌体发发生明明显的的形态态变化化,同同时发发生细细胞膜膜渗透透性的的变化化（8））CO2固定酶酶系活活力强强（9））异柠柠檬酸酸裂解解酶活活力欠欠缺或或微弱弱,乙乙醛酸酸循环环弱（10）氧氧化能能力缺缺失或或微弱弱（11）还还原性性辅酶酶Ⅱ进入呼呼吸链链能力力弱（12）柠柠檬酸酸合成成酶、、乌乌头酸酸酶、、异异柠檬檬酸脱脱氢酶酶以及及谷氨氨酸脱脱氢酶酶活力力强（13）能能利用用醋酸酸,不不能利利用石石蜡（14）具具有向向环境境中泄泄漏谷谷氨酸酸的能能力（15）不不分解解利用用谷氨氨酸,并能能耐高高浓度度的谷谷氨酸酸,产产生谷谷氨酸酸5％％以上上74二.国国内内谷氨氨酸生生产菌菌及其其比较较国内谷谷氨酸酸发酵酵已有有40年历历史.目前前使用用的菌菌株主主要有有:北京棒棒杆菌菌(AS.1299)7338S-941WTH-1钝齿棒棒杆菌菌(AS1.542)、、HU7251、、B9B9-17-36F-263天津短短杆菌菌(T6-13)FM-8207FM-415U-9CMTC6282TG-3TG-866D85等菌菌株多数厂厂家常常用:B9T6-137338等等75（一））、北北京棒棒杆菌菌（7338））与钝钝齿棒棒杆菌菌（B9））的比比较在实际际生产产中，，7338菌株株与B9菌菌株的的主要要区别别如下下：①细胞胞大小小与细细胞形形态B9的的细胞胞明显显大于于7338菌∴∴在发发酵液液提取取GA上容容易与与菌分分离，，提取取容易易，发发酵稳稳定。。而7338因因菌体体细胞胞小，，相对对受噬噬菌体体污染染稍轻轻。B9菌菌在发发酵过过程中中有明明显的的菌体体形态态变化化，菌菌体发发生伸伸长膨膨大大，而而7338菌在在发酵酵过程程中的的形态态变化化，相相对不不够明明显。。76②菌菌体本本身的的等电电点不不同7388在在PH4.2-3.0。。特别别3.5-3.0菌菌大量量沉降降，同同GA等电电点∴菌菌分离离困难难，而而B9不在在此范范围，，易分分离③菌菌落颜颜色7338乳乳白色色B9为为草黄黄色发酵过过程分分泌色色素少少77④脲脲酶7388B9活力低低∴∴耐受受力强强活活力力高耐耐受低低初尿可可达1.8-2.0％初初尿尿0.8流尿2-3次次流流尿尿4-6次⑤生生物素素用量量要求范范围狭狭窄4-5ug/l较较粗放放5-8ug/l（（由由初糖糖定））⑥生生长长因子子都以生生物素素为必必需生生长因因子，，7388还还需要要硫胺胺素78⑦发发酵周周期7388后后劲足足，，而前前期却却不明明显，，∴∴周周期稍稍长⑧噬噬菌菌体类类型不同，，不不交叉叉感染染，，可相相调换换⑨酯酯酶谱谱带蛋蛋白酶酶谱带带，，代谢谢产物物都不不尽相相同。。79㈡天天津津短杆杆菌（（T6-13）与纯齿棒棒杆菌（B9）的比比较①细胞大大小：小小且多多，泡沫稍稍大提取比B9困难②菌体形形态斜斜面淡淡白色草草黄色发酵中形态态变化比B9大前期细胞比比较短，圆圆滚滚，16h后后拉长3倍倍以上③发发酵温度度前32-34℃℃前前30-32℃℃`中中后36-38℃℃中中后后34-35℃℃（（有利利于夏天降降温条件差差的工厂））80④脲酶活活力更更强初初尿0.5-0.6％宜少量多次次⑤生物素素用量比比B9低20％％左右⑥糖酸转转化率不同同45%以上40-45%⑦噬菌体体类型相相同⑧胶体量量分分泌泌胶体较多多会干扰等电电点GA结结晶和菌体体分离⑨菌体本本身等电点点接近谷氨酸酸等电点提提取取收率较高高为4.2-3.0之间81三、谷氨酸酸生产菌在在发酵过程程中的形态态变化在生产中发发现GA生生产菌发酵酵过程中会会发现明显显的菌体形形态的变化化。在发酵酵过程中发发现菌体形形态有明显显的变化时时，正是产产GA的激激增时间。。但在发酵培培养基含有有过剩生物物素的培养养条件下，，菌体形态态则没有明明显变化，，却呈现耗耗糖长菌菌不产谷谷氨酸的异异常发酵。。82㈠种子子的菌体形形态将斜面和一一、二级级种子培养养的菌体，，用结晶紫紫染色，经经显微观察察，发现B9菌，在在一、二二级种子和和斜面种子子培养的不不同培养条条件下，细细胞形态基基本形似，，稍有差异异。斜面菌稍小小，一、、二级种子子菌体大而而粗壮，革革兰氏染色色深。。0.7-0.9×1.0～3.4um折折断断分裂成V字形，，为谷氨氨酸非积累累型细胞。。83㈡谷氨氨酸发酵不不同阶段的的菌体形态态生物素为VB的一种，也也叫做或辅辅酶R，，参与脂肪肪酸生物合合成限速反反应的关键键酶，乙酰酰CoA羧羧化酶的的辅酶，，参与脂肪肪酸合成。。通过控制生生物素亚适适量，使发发酵7-10h后，，生物素处处于贫乏状状态。16-20h后，生物物素消耗完完，完成谷谷氨酸非积积累型细胞胞向积累型型细胞转化化，表现为为OD值稳稳定，GA产量直线线上升，直直至发酵结结束。84从GA发酵酵中菌形态态变化来看看，可分为为三个时期期：以发酵30-36h的正常GA发酵为为例：发酵0-8h或0-10h为为长菌型细细胞，形态态与二级种种子相似短短杆至棒状状菌呈单个个、成对对或“V””字型发酵8-18h或10-20h为转移移期细胞，，此阶段细细胞形态急急剧变化。。细胞开始始伸长、膨膨大。从从GA非积积累型细胞胞向GA积积累型细胞胞（产酸型型细胞）转转化，转移移期有长菌菌型细胞，，也有产酸酸型细胞，，产酸速度度逐渐加快快。85发酵16-20h后后为产酸型型细胞，细细胞为含磷磷脂不足的的异常形态态，呈现伸伸长、膨膨大、不不规则，缺缺乏“V”字型排排列，有的的呈弯曲形形，边缘颜颜色浅，稍稍模糊，有有的边缘折折绉及至残残缺不齐，，但菌体形形态基本清清楚。在发发酵后期，，细胞较长长，多呈现现有明显的的横隔（1-3个或或更多）的的多节细胞胞，类似花花生状，产产酸高，在在糖酸转化化率高时尤尤甚。86㈢GA发酵感染染噬菌体后后的形态感染噬菌体体形态也也会发生改改变。感染噬菌体体时期不同同改变也也不同1.前期期染噬菌体体镜检可见细细胞明显减减少，细胞胞不规则、、发圆、发发胖、缺缺乏“V””字形排列列视野中中有明显的的细胞碎片片，严重时时出现蛛丝丝、拉网网，互相相堆在一起起。几乎找找不到完整整的菌体细细胞，类似似蛛网或鱼鱼鳞状，生生产上表现现为排气口口CO2迅速下降，，相继出现现OD值下下跌PH上上升或不上上升，耗糖糖缓慢等异异常发酵，，应立即停停止发酵进进行救治。。872、发酵中中、后期期感染噬菌菌体的菌体体形态菌体细胞形形态不规则则，边缘缘不整齐有有的边缘缘似乎有许许多毛刺状状的东西。。有细胞碎碎片，不同同于正常发发酵的产酸酸细胞。一一般说在生生产上中、、后期感感染噬菌体体，OD值值虽下降，，也常伴有有泡沫多、、黏度大、、耗糖缓慢慢等异常现现象，但及及时补加适适量营养物物，一般仍仍可完成发发酵，产酸酸在4％左左右，但需需注意，由由于噬菌体体侵染细胞胞后会使细细胞内GA溢出，有有时产酸会会反而偏高高，会使噬噬菌体忽视视，这很危危险。仍需需注意采取取措施加以以防治。88四．谷谷氨酸发酵酵的代谢控控制育种1.日常常菌种工作作①定期分分纯②小剂量诱诱变刺激：：可淘汰生生长微弱的的菌株。③高产菌制制做安培瓶瓶。2.选育育耐高渗透透压菌株①耐高高糖选育在20-30％％葡萄糖的的平板上生生长好的突突变株。②耐高高谷氨酸选育在15-20％％味精的平平板上生长长好的突变变株。③耐高高糖、高高谷氨酸选育在20％葡萄糖糖，加15％味精的的平板上生生长好的突突变株。893.选选育不分解解利用谷氨氨酸的突变变株使用不分解解利用GA，切断继继续续向下氧化化的反应，，即选育以以谷氨酸为为唯一碳源源，菌体不不长或生长长微弱的突突变株。平板法：选选育不长或或生长微弱弱的菌。摇瓶法：选选育OD值值净增极少少的菌。904.选选育细胞膜膜渗透性好好的突变株株①抗VP类衍生物②选育溶溶菌酶敏感感性突变株株③选育二二氨基庚二二酸缺陷型型突变株二氨基庚二二酸为细胞胞壁的组成成成分④选育温度度敏感突变变株915.选选育强化CO2固定反应的的突变株①选育以以琥珀酸为为唯一碳源源的培养基基上生长快快、大的的菌株②选育氟氟丙酮酸敏敏感性突变变株氟丙酮酸是是丙酮酸脱脱氢酶的抑抑制剂，菌菌种对氟丙丙酮酸越敏敏感，说明明菌种丙酮酮酸向乙酰酰CoA的的转化反应应越弱，相相对地固定定反应占的的比例也就就越大。926．选育育减弱乙醛醛酸循环的的突变株四碳二羧酸酸是由CO2固定反应和和乙醛酸循循环所提供供的，减弱弱乙醛酸循循环，固定定反应所占占的比例就就会增大，，谷氨酸的的产率就高高①选育琥琥珀酸敏感感型突变型型琥珀酸是乙乙醛酸循环环关键酶异异柠檬酸裂裂解酶的阻阻遏物，菌菌体对琥珀珀酸越敏感感，异柠柠檬酸裂解解酶的合成成能力就越越弱，乙醛醛酸循环就就越弱。②选育不不利用醋酸酸的突变株株。937.选育育强化TCA中从柠柠檬酸到代代谢的的突变株①选育柠柠檬酸合成成酶强的突突变株柠檬酸合成成酶是三羧羧酸循环的的关键酶，，强化该酶酶能加强GA的生物物合成。②选育育抗氟乙酸酸、氟化化钠、氮氮杂丝氨酸酸、氟柠柠檬酸等突突变株这些物质都都是乌头酸酸酶的抑制制剂，抗这这些物质的的突变株，，可强化乌乌头酸酶的的活力948.选育育解除谷氨氨酸对谷氨氨酸脱氢酶酶反馈调节节的突变株株谷氨酸比天天冬氨酸优优先合成①选育酮基基丙二酸抗抗性突变株株②选育耐高高谷氨酸突突变株③选育抗谷谷氨酸结构构类似物突突变株④选育抗谷谷氨酰胺的的突变株959.选育育强化能量量代谢的突突变株GA高产菌菌的两个显显著的特点点是继继续向下氧氧化的能力力缺陷和乙乙醛酸循环环微弱，使使得GA菌菌能量代谢谢受阻，TCA前一一段的代谢谢（柠檬酸酸合成到生生成））减慢慢，强化能能量代谢可可补救上述述两个特点点造成的不不足，使TCA前一一段的代谢谢加强，GA合成的的速度加强强。①抗呼吸吸链抑制剂剂突变株如抗丙二酸酸，氧化化丙二酸，，氰化钾钾等的突变变株②抗ADP磷酸酸化抑制剂剂突变株，，如抗2.4-二硝硝基酚、羟羟胺、砷、、胍等的突突变株③抗抑制制能量代谢谢抗生素的的突变株，，如抗缬氨氨霉素、、寡霉素等等突变株9610.选选育减弱弱HMP途途径后段酶酶活性的突突变株∵通过过HMP途途径也可生生成核糖、、核苷酸、、莽草酸、、芳香族氨氨基酸、辅辅酶Q、叶叶酸等物物质。这些些物质生成成消耗了葡葡萄糖，使使谷氨酸的的产率降低低。如果削削弱或切断断这些物质质的合成，，就会使Glu的产产率增加①选选育育莽莽草草酸酸缺缺陷陷型型或或添添加加芳芳香香族族AA能能促促进进生生长长的的突突变变株株②选选育育抗抗嘌嘌呤呤、、嘧嘧啶啶类类似似物物突突变变株株③选选育育抗抗核核苷苷酸酸类类抗抗生生素素突突变变株株，，如如抗抗德德夸夸菌菌素素、、狭狭霉霉素素C等等突突变变株株。。97五．．菌菌种种的的扩扩大大培培养养和和种种子子质质量量要要求求斜面面菌菌株株→→一一级级种种子子培培养养→→二二级级种种子子培培养养→→发发酵酵罐罐㈠菌菌种种的的扩扩大大培培养养斜面面菌菌种种的的培培养养有利利于于菌菌种种生生长长而而不不长长酸酸，，并并要要求求斜斜面面菌菌种种绝绝对对纯纯，，不不得得有有杂杂菌菌、、噬噬菌菌体体，，培培养养基基以以多多含含有有机机氮氮而而不不含含或或少少糖糖为为原原则则。。①斜斜面面培培养养基基葡萄萄糖糖0.1％％蛋蛋白白胨胨1.0％％牛牛肉肉膏膏1.0％％氯氯化化钠钠0.5％％琼琼脂脂2.0-2.5％％PH7.0-7.2％％②培培养养条条件件7338、、B930-32℃℃T6-1333-34℃℃培培养养18-21h要求求菌菌苔苔颜颜色色、、边边缘缘正正常常，，斜斜面面只只移移接接三三代代不不宜宜多多次次移移种种。。982.一一级级种种子子培培养养目的的：：培培养养大大量量繁繁殖殖活活力力强强的的菌菌体体①培培养养基基组组分分：：少少含含糖糖分分，，多多含含有有机机氮氮以以有有利利长长菌菌考考虑虑葡萄萄糖糖2.5％％尿尿素素0.5%硫硫酸酸镁镁0.04%磷磷酸酸氢氢二二钾钾0.1%玉玉米米浆浆2.5-3.5%（（按按质质增增减减））FeSO42ppmMnSO42ppmPH7.099②培培养养条条件件1000ml三三角角瓶瓶装装200ml,灭灭菌菌后后置置于于冲冲程程7.6cm频频率率96次次/min往往复复式式摇摇床床上上振振荡荡培培养养12h7338B930-32℃℃T6-1333-34℃℃③一一级级种种子子质质量量要要求求：：种龄龄12hPH值值6.4±±0.1光光密密度度净净增增OD值值0.5以以上上残残糖糖0.5%以以下下无菌菌检检查查㈠㈠噬噬菌菌体体检检查查：：无无镜检检：：菌菌体体生生长长均均匀匀、、粗粗壮壮、、排排列列整整齐齐。。1003.二二级级种种子子培培养养种子子罐罐容容积积大大小小取取决决于于发发酵酵罐罐大大小小和和接接种种量量比比例例①培培养养基基组组成成在在实实际际生生产产中中应应根根据据菌菌体体生生长长情情况况酌酌情情增增减减生生物物素素等等用用量量，，随随时时调调整整培培养养基基组组成成。。②培培养养条条件件接种种量量0.8-1.0%培养养温温度度32℃℃（（T6-13