hTERC基因在宫颈上皮癌变过程中的表达及诊断意义,医学检验论文

hTERC基因在宫颈上皮癌变过程中的表达及诊断意义,医学检验论文

液基细胞学检查的广泛应用明显降低了宫颈癌的发病率，但其筛查敏感度较低，易出现假阴性结果［1］。HPV感染是宫颈癌发病的首要因素，HPVDNA检测也成为宫颈癌筛查的一种重要手段，但由于大多数HPV感染具有自限性，很少进展成高级别病变，因而HPV检测在宫颈癌筛查中特异度也偏低，易出现假阳性结果［2］。且上述筛查手段(包括联合筛查)仅把可能的宫颈病变找出来，对早期病变的进展及转归无法准确判定，故筛查结果并不是特别可靠的恶变潜能指标。因而，临床上迫切需要一种新的方式方法和指标以早期发现尚处于低度病变的高危患者。近年来研究发现，人端粒酶ＲNA基因(humantelomeraseＲNAcomponentgene，hTEＲC)的异常表示出是肿瘤发生的基础，hTEＲC基因的异常扩增可以能是宫颈癌构成的早期事件［3，4］。本文通过FISH技术分析了hTEＲC基因在宫颈上皮癌变经过中的表示出，评估hTEＲC基因检测的临床价值，为宫颈CIN的早发现、早诊断提供实验根据。

1材料与方式方法

1.1材料收集并挑选2018-052020-05间在本院专科就诊的115例宫颈活检组织标本，参照(病理学〕诊断标准［5］，分为正常组(包括炎症者)25例，CINⅠ27例，CINⅡ26例，CINⅢ18例，宫颈癌(鳞癌)19例;患者年龄18～64岁，平均37.3岁。所有标本均由2名高年资病理医师统一确定诊断。FISH所用GSPTEＲC/CSP3探针由广州安必平医药科技有限公司提供。

1.2方式方法

1.2.1组织制片所有活检标本经4%中性甲醛固定6～24h，全自动组织脱水机处理，常规石蜡包埋，4m厚切片，65℃下烤片过夜备用。

1.2.2检测前预处理65℃烤片5min，室温下二甲苯20min2;100%乙醇5min1;依次100%、85%、70%乙醇各1次3min，去离子水3min。100℃的沸水20min，晾干。37℃蛋白酶K工作液消化8～20min，镜下观察，消化适宜后，2SSC溶液中漂洗5min2。依次70%、85%、100%乙醇脱水，各3min，室温晾干。

1.2.3FISH检测①避光滴加10l杂交液(含探针)，荧光原位杂交仪上变性及过夜杂交(变性温度831℃，5min;杂交温度42℃)。②次日移去盖玻片，放入461℃的2SSC溶液5min2。70%乙醇3min，暗处自然枯燥。滴加10lDAPI复染剂，暗处－20℃放置20min后，荧光显微镜下观察。

1.3结果断定①信号断定:GSPTEＲC探针的荧光信号为红色，CSP3对照探针信号为绿色。正常细胞间期胞核中红、绿信号各2个，若单个胞核中红色信号＞2个，绿色信号2个，则该细胞为TEＲC基因扩增异常细胞。②阈值建立:参照文献［6］报道，取20例正常宫颈标本，以上述方式方法行FISH实验，每例分析100个细胞，统计出现TEＲC基因扩增异常细胞数目的百分比。异常阈值=平均数+3标准差。本研究TEＲC阈值=7.13%，故设8%为异常阈值，判定TEＲC基因扩增结果阳性。③结果判读:每例样本随机计数100个细胞，若异常细胞数的百分比＞阈值，为(+);若＜阈值，为(－);若等于阈值，则加大观测细胞数。

1.4统计学分析采用SPSS13.0统计学软件分别进行2检验、Fisher确切概率法、Spearman等级相关分析及方差分析，绘制ＲOC曲线，计算ＲOC曲线下面积;以病理为最终诊断计算hTEＲC基因检测对辨别高级别宫颈病变(CINⅡ)的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值和诊断比值比。

2结果

2.1hTEＲC扩增率115例宫颈活检组织标本中，hTEＲC基因在正常组、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈鳞状细胞癌组中的扩增率分别为4%、22.2%、73.1%、83.3%和94.8%，hTEＲC基因的扩增率随着病变程度的加重而增高，各组间差异显着(P＜0.01)，尤其当宫颈病变由低级别(CINⅠ)转变为高级别甚或癌时(CINⅡ)，hTEＲC基因的扩增率显着升高(2=13.75，P＜0.01)。同时，hTEＲC基因的扩增率与病变的恶性程度呈正相关(r=0.696，P＜0.01)(表1)。

2.2hTEＲC基因阳性扩增的异常细胞数hTEＲC基因扩增的异常细胞数在宫颈低级别病变(正常和CINⅠ)时就可出现，但均处于较低水平，差异不显着(P＞0.05);而当病变由低级别转变为高级别(CINⅡ)时，异常细胞数则显着提高(F=25.42，P＜0.01)，且稳定在较高水平(CINⅡ～癌组间无差异，P＞0.05)。hTEＲC基因扩增的异常细胞数与宫颈病变的恶性程度呈明显正相关(r=0.721，P＜0.01)，同时，随着宫颈病变的加重，hTEＲC基因多重比例扩增率(红∶绿之比为4∶2、5∶2、4∶4、6∶5者)具有升高趋势(表1，图1～4)。

2.3hTEＲC基因检测对预测宫颈高级别病变的临床评价在宫颈高、低级别病变各组中，hTEＲC基因扩增率及异常细胞数无差异(P＞0.05)，故将其各自合并成2组(表2)。63例高级别病变中hTEＲC基因扩增52例，阳性率82.5%;52例低级别病变中hTEＲC基因扩增7例，阳性率13.5%;两者差异显着(P＜0.01)。hTEＲC基因检测宫颈高级别病变的敏感度为82.5%，特异度为86.5%，阳性预测值88.1%，阴性预测值80.4%，诊断准确度84.4%，阳性似然比6.1，阴性似然比0.2，诊断比值比30.5;其ＲOC曲线下面积达0.862(图5)。

3讨论

宫颈癌的有效筛查和早期诊断是降低其发生率和病死率的关键。高危型HPV感染和整合是公认的宫颈细胞癌变的致病因素，但需要宿主遗传因素的介入才能导致细胞的恶性转化［6］。研究表示清楚，宫颈上皮细胞瘤变经过中几乎均伴有3号染色体长臂的扩增，华而不实最重要的就是编码人端粒酶主体构造的端粒酶mＲNA基因(hTEＲC)。hTEＲC基因的表示出上调可激活端粒酶活性而维持端粒长度，引起染色体异常，使细胞逃避凋亡，导致宫颈癌发生。

hTEＲC基因的扩增可出如今宫颈病变早期，且扩增率与宫颈病变程度显着相关。Heselmeyer-Haddad等［7］最早采用FISH方式方法研究宫颈细胞涂片中hTEＲC基因的表示出情况，发现正常、ASC、LSIL标本中只要少数病例hTEＲC基因扩增，而在CINⅡ、Ⅲ组中hTEＲC基因的扩增比例分别达63%和76%，且四倍体细胞数和hTEＲC基因扩增率随宫颈病变的严重程度而增加。Andersson等［8］研究也发现，hTEＲC基因扩增率在正常组和CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ分别为7%、24%、64%和91%，在宫颈癌组达100%，hTEＲC基因的阳性率随着病变的加重而增高，尤其是在CINⅠ和Ⅱ之间愈加明显。进一步的随访研究还发现［3］，有hTEＲC基因扩增的低级别上皮内瘤病病例1～3年进展为高级别者达40.7%，而自愈者则无1例存在hTEＲC基因扩增;并且33%细胞学正常而hTEＲC基因扩增者，在经过短暂的潜伏期后可进展为高级别病变;hTEＲC基因扩增者恶性转化率达52%～96%，hTEＲC基因扩增对于判定CINⅠ/Ⅱ向CINⅢ进展的敏感性到达100%，特异性为70%。由此可见，hTEＲC基因同时也是一个可靠的预测宫颈病变进展的生物学因子。

本研究中，hTEＲC基因在正常宫颈组织和CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ及宫颈鳞状细胞癌中的阳性扩增率分别为4%、22.2%、73.1%、83.3%和94.8%，随病变严重程度增加hTEＲC基因扩增率也增加，两者具有较明显的正相关关系，与上述研究结果一致;并且hTEＲC基因的扩增在宫颈病变的早期尤其是CINⅠ中就可出现，且这种基因的改变伴随着从CINⅠ至CINⅢ及宫颈鳞状细胞癌的全经过。可见，hTEＲC基因扩增与CIN的严重程度有关，可能是宫颈癌构成的早期事件。值得注意的是，在本研究中，当病变由低级别病变(CINⅠ)进展为高级别时(CINⅡ)，hTEＲC基因扩增率由22.2%增高到73.1%，异常细胞数也由5.86.2增高到25.918.2，变化显着，提示hTEＲC基因的异常扩增在宫颈CINⅠ向CINⅡ进展经过中扮演着重要角色，可能与宫颈病变不可逆转的恶性转化密切相关，而这一特点有助于临床预测CINⅠ/Ⅱ的进展或转归，可以辅助常规病理对CINⅠ和CINⅡ的诊断与分级。本研究还显示，随着宫颈病变的加重，hTEＲC基因多重比例扩增率有升高趋势，即hTEＲC基因和3号染色体同时发生了非整倍体扩增，提示细胞恶性度增加。这与文献报道一致［9，10］。因而，通过检测hTEＲC基因扩增情况并分析hTEＲC基因扩增类型，有助于评估宫颈病变的严重程度，预测宫颈病变的恶性转化潜能［1，8］。

hTEＲC基因作为诊断宫颈病变的生物遗传学指标，其鉴别宫颈低级别病变(CINⅠ)和高级别病变(CINⅡ)的敏感度和特异度一般在63.9%～90%和81.9%～93.3%［10－12］。近期的一项Meta分析［13］显示，hTEＲC基因诊断高级别病变的合并敏感度、特异度和诊断优势比分别为0.81、0.83和17.4，其ＲOC曲线下面积为0.891;与常规筛查方式方法相比［2］，其敏感度高于液基细胞学检查(53.9%)，而低于HPV检测(91.3%);其特异度高于HPV检测(39.3%)，但比液基细胞学检查低(93.3%);其诊断准确度及ＲOC曲线下面积略高于其他两者;讲明hTEＲC基因单独用于筛查宫颈高级别病变有较高的诊断价值，但其筛查效率的优势并不明显。本研究中，采用石蜡标本进行hTEＲC基因FISH检测，结果显示，hTEＲC基因扩增对辨别宫颈高级别病变的敏感度和特异度分别为82.5%和86.5%，诊断准确度为84.4%，诊断优势比30.5，ＲOC曲线下面积达0.862，与上述的研究结果基本一致。但hTEＲC基因扩增对宫颈高级别病变的阳性预测值到达88.1%，讲明hTEＲC基因扩增的病例宫颈发生恶性转化率较高，这与Heselmeyer-Haddad等［3］在宫颈细胞学水平的研究结果一样。

hTEＲC基因既是一个与宫颈病变程度密切相关的遗传标记物，又是一个较为可靠的预测恶变潜能的分子标记物，可作为宫颈病变早期筛查、检测病情、评估预后的辅助指标。但单独使用时辨别宫颈高级别病变没有能表现明显的优越性，加上其检测成本昂贵，需要特殊设备和专业人员，尚不合适在宫颈癌普查中广泛运用。由于石蜡标本hTEＲC基因FISH检测稳定可靠，对CINⅡ病变的诊断敏感度和特异度等指标均＞80%，对常规病理鉴别CINⅠ与CINⅡ有困难时或由于人为因素影响CIN级别判定时，可起重要的辅助作用，可明确组织分级、减少漏诊误诊、避免临床治疗缺乏或过度治疗。同时，由于hTEＲC基因具有预测恶变风险作用，有助于及早发现尚处于低度病变的高危患者，有利于临床及时采取干涉措施，减少宫颈高级别病变的发生;对临床常见的复发性低级别CIN，hTEＲC基因检测可为判定宫颈病变的进展或转归提供一种有力的根据。

在常规的临床实践中，选择性地联合使用hTEＲC基因检测及细胞学检查和HPV检测这两项传统的宫颈癌筛查技术，将有助于提高对宫颈癌前病变的检出率，降低宫颈癌的发病率和死亡率。

以下为参考文献:

［1］BrownAJ，TrimbleCL．Newtechnologiesforcervicalcancerscreening［J］．BestPractＲesClinObstetGynaecol，2020，26(2):233－242．

［2］JiangJ，WeiLH，LiYL，etal．DetectionofTEＲCamplificationincervicalepithelialcellsforthediagnosisofhigh-gradecervicallesionsandinvasive