生物技术在天然药物研究中的应用

关于生物技术在天然药物研究中的应用第一页，共七十五页，2022年，8月28日

绪论一天然药物生物转化基本概念

生物转化技术:应用植物细胞培养体系、微生物或酶等生物体系对外源化合物进行合成和结构修饰。天然药物生物转化：利用生物转化技术对天然活性化合物进行合成和结构修饰。第二页，共七十五页，2022年，8月28日喜树碱人参皂苷Rh2紫杉醇第三页，共七十五页，2022年，8月28日二天然药物生物转化的发展第一阶段：植物组织和细胞培养罗汉果怀地黄人参第四页，共七十五页，2022年，8月28日第二阶段：悬浮细胞培养紫草红豆杉黄芪第五页，共七十五页，2022年，8月28日三天然药物生物转化的特点1.专一性强2.副产物少、产量高3.反应条件温和常温常压pH近中性4.可以进行化学方法难以进行的反应第三阶段：微生物、酶转化技术的应用泼尼松第六页，共七十五页，2022年，8月28日四生物转化在天然药物研究中的应用1.为天然药物的生产提供有效途径2.为天然药物的结构修饰与设计提供新的工具3.结合药物筛选,为新药开发提供了研究手段4.提高天然活性成分的生物利用度5.成为中药制剂中除去大分子杂质的有效方法第七页，共七十五页，2022年，8月28日

天然药物的微生物转化一微生物转化的应用

微生物转化:通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰,也就是利用微生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的催化反应。特点:生物量积累快转化时间短转化酶表达效率高便于工业化生产第八页，共七十五页，2022年，8月28日（一）在有机合成领域的应用

应用于微生物转化的酶：乙酰转移酶、糖苷酶、糖基转移酶、环氧酶、羟基化酶、醛缩酶等。

六大类：氧化还原酶类转移酶类水解酶类裂合酶类异构酶类合成酶（连接酶）类第九页，共七十五页，2022年，8月28日优点：高度选择性（化学、区域、非对映体、对映体选择性）反应条件温和酶种类多样酶量充足转化效率高产品质量稳定对环境污染少缺点：酶易失活（pH、温度和高盐浓度）产物和底物的抑制现象第十页，共七十五页，2022年，8月28日1.手性化合物合成与拆分

“反应停”（沙利度安）事件

R-对映体镇静作用

S-对映体致畸作用

手性化技术：色谱法化学不对称合成法生物合成与拆分法第十一页，共七十五页，2022年，8月28日项目色谱法化学法生物法生产效率选择源手性源产率产物回收操作条件生产成本必需条件生产规模开发周期开发成本法律限制低较高需要较高简单常温常压高基础和方法研究小短低小高变动需要变动一般高温高压可变需要新反应验证可大长高大中高不需要高比较复杂常温常压中酶筛选、酶工程可大较短中一般三种手性化技术方法的比较第十二页，共七十五页，2022年，8月28日生物合成手性化合物：外消旋体拆分为两个光活性对映体酶催化生成不对称的光活性产物实例：消旋布洛芬酰胺RhodococcusAJ270S-布洛芬黑根酶>90%第十三页，共七十五页，2022年，8月28日2.食品添加剂的合成

维生素C的合成D-葡萄糖H2/NiD-山梨醇L-山梨糖2-酮基-L-古龙酸维生素C乙酸杆菌混合菌烯醇化、内酯化第十四页，共七十五页，2022年，8月28日香草醛的合成微生物-氧化诺卡菌第十五页，共七十五页，2022年，8月28日（二）在新药开发中的应用

新药合成：化学合成生物转化生物转化方法：

天然活性成分（先导化合物）结构新颖的化合物发现关键活性成分利用多种不同催化功能的酶系第十六页，共七十五页，2022年，8月28日（三）作为体外模型预测代谢

药物代谢：研究药物分子在体内以不同的规模发生的生物化学转化

Ⅰ相代谢functionalization：氧化、还原、水解

Ⅱ相代谢conjugation：葡萄糖醛酸结合、硫酸结合、谷光甘肽结合

预测代谢的优点：可提供大量的筛选模型成本较低、操作简单、易于控制调节优化条件，显著提高代谢产物收率，作为代谢产物的对照品进行药理和毒理研究减少实验动物用量第十七页，共七十五页，2022年，8月28日二微生物转化方法（一）微生物转化的反应1.应用于氧化反应（1）脱氢反应细菌（2）羟基化反应放线菌2.应用于水解反应细菌、酵母菌和霉菌3.应用于还原反应酵母菌和霉菌4.应用于酰基化反应细菌5.应用于降解反应细菌6.应用于脱水反应细菌和霉菌第十八页，共七十五页，2022年，8月28日（二）微生物转化的一般过程1.选择菌种2.制备培养基3.加转化底物4.添加刺激剂或抑制剂5.控制好转化反应培养时间6.调控好影响因素7.控制好转化反应终点8.分离纯化转化产物第十九页，共七十五页，2022年，8月28日（三）几种常用的微生物转化方法1.分批培养转化法2.利用酶进行生物转化3.应用渗透细胞进行生物转化4.应用孢子进行生物转化5.应用固定化细胞进行生物转化6.应用干燥细胞进行生物转化7.静息细胞转化法第二十页，共七十五页，2022年，8月28日（四）微生物转化反应的特点1.反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快2.可以减少反应步骤3.对立体结构合成上具有高度的专一性4.回收率高、成本低第二十一页，共七十五页，2022年，8月28日三微生物转化的影响因素1.转化的时间和温度2.底物添加方法3.酶的抑制剂4.酶的诱导剂5.生长调节剂第二十二页，共七十五页，2022年，8月28日四新技术在微生物转化中的应用1.基因工程技术2.固定化细胞转化技术3.双水相转化技术4.超声波技术5.有机介质中的微生物转化6.生物反应器的应用7.核磁共振、质谱技术第二十三页，共七十五页，2022年，8月28日五天然药物的微生物转化结构修饰和改造复杂结构天然产物转化产生新的组合天然化合物群改变药物的功能疗效定向合成天然活性成分含量低以微生物为反应器定向合成第二十四页，共七十五页，2022年，8月28日（一）喜树碱喜树碱，20(S)-camptothecin，CPT1966年美国化学家Wall和Wani从喜树CamptothecaacuminataDecne中分离得到具有较强抗肿瘤和抗病毒活性的生物碱成分不具有明显的生物碱性质近中性分子不溶于酸，与酸不成盐，难溶于水及一般有机溶剂可溶于吡啶、二甲基亚砜、乙酸和氯仿与甲醇的混合液，呈蓝色荧光对光、热敏感，光照射后，吸光度降低，避光稳定，加热可使喜树碱分解

分子式C20H16N2O4M348.36

熔点258-263℃第二十五页，共七十五页，2022年，8月28日拓扑特肯，Topotecan，TPT依诺替康，Irinotecan，CPT-11羟喜树碱动物药理和临床试验证明，羟喜树碱有较好的治疗效果和较低的毒副反应

1977年，国内通过鉴定，治疗肝癌、胃癌和白血病等喜树碱及其衍生物对卵巢癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、直肠癌和白血病等恶性肿瘤均有一定的疗效

1992年，TPT和CPT-11获美国FDA认证，是卵巢癌和结肠癌的特效抗肿瘤药物第二十六页，共七十五页，2022年，8月28日

羟喜树碱得率非常低，约为生药的十万分之二提取过程需用大量有毒的氯仿和甲醇利用含量较高的喜树碱（万分之七）生物转化曲霉T-36黄曲霉T-41920%50%第二十七页，共七十五页，2022年，8月28日（二）雷公藤内酯

中药雷公藤来源于卫矛科植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.的根、叶及花产于福建、浙江、安徽、湖南、湖北、贵州等地，主要分布在长江中下游地区临床上治疗类风湿性关节炎、

肾小球肾炎、

系统性红斑狼疮、

麻风病、

自身免疫性疾病、

皮肤病第二十八页，共七十五页，2022年，8月28日

化学成分有生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类、糖和木质素类雷公藤二萜属松香烷型二萜，多数具有,-不饱和内酯结构具有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗肿瘤等多种显著生理活性肾毒性大，限制了临床应用雷公藤甲素的微生物转化雷公藤甲素5-羟基19-羟基19-羟基16-羟基雷公藤乙素15-羟基1-羟基Cunninghamellablakesleana第二十九页，共七十五页，2022年，8月28日雷公藤内酯酮的微生物转化Aspergillusniger雷公藤内酯酮雷公藤甲素17-羟基16-羟基5-羟基

除19-位羟基化产物外，大多数转化产物表现出较强的体外细胞毒活性对BGC-823、Hela、HL-60、KB等人癌细胞株IC5010-8-10-7M均比底物有所降低第三十页，共七十五页，2022年，8月28日（三）鬼臼毒素

小檗科植物喜马拉雅鬼臼Podophyllumemodi和美洲鬼臼P.peltatum分离得到

1946年King和Sullivan证实鬼臼树脂和鬼臼毒素对动物实验癌细胞有破坏作用副作用太大，影响临床应用

50年代开始对鬼臼毒素进行结构改造鬼臼毒素，Podophyllotoxin

无色针状结晶分子式C22H22O8M414

熔点112-117℃

溶于乙醇、氯仿、丙酮、热苯、

冰醋酸第三十一页，共七十五页，2022年，8月28日70年代出现2个半合成抗肿瘤药物鬼臼乙叉苷，Etoposide，VP-16鬼臼甲叉苷，Teniposide，VM-26依托泊苷特尼泊苷1984和1992年，美国FDA批准依托泊苷和特尼泊苷上市全球市场份额达40-100亿美金两种抗癌药对淋巴肉瘤、膀胱癌、乳腺癌和儿童急性白血病有效第三十二页，共七十五页，2022年，8月28日依托泊苷对小细胞肺癌、淋巴瘤疗效显著对卵巢癌、乳腺癌、神经母细胞瘤也有效

毒副作用大、生物利用率低和难溶于水NPFGL331第三十三页，共七十五页，2022年，8月28日（四）蟾毒配基

蟾酥为两栖纲无尾目蟾蜍科中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor和黑眶蟾蜍

BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮肤腺分泌物的干燥物复方和中成药配伍中具有重要地位如“六神丸”和“症喉丸”西欧，17-18世纪用蟾皮干燥粉末治疗浮肿蟾酥主要有效成分为蟾毒配基类bufogenins化合物，具有很强的强心升压作用蟾毒配基类化合物基本骨架第三十四页，共七十五页，2022年，8月28日

华蟾毒精、蟾毒灵和脂蟾毒配基的含量最高，三者约占药材干重10%

具有强心、局部麻醉、抗休克、抗病毒、抗肿瘤等生理活性对肿瘤细胞IC501-100nM蟾毒灵活性尤为显著抗肿瘤的作用机制通过诱导细胞凋亡，促进细胞分化cinobufagin华蟾毒精bufalin蟾毒灵resibufogenin脂蟾毒配基第三十五页，共七十五页，2022年，8月28日华蟾毒精的微生物转化

Mucor，Alternaria，Syncephalastrum

选择链格孢A.alternataAS3.4578制备转化华蟾毒精++3-羰基-12-羟基12-羟基12-羟基-去乙酰3-羰基-12-羟基3-羰基-12-羟基-去乙酰12-羰基第三十六页，共七十五页，2022年，8月28日蟾毒灵的微生物转化

选择刺囊毛霉MucorspinosusAS3.3450制备转化蟾毒灵1-羟基15

-羟基15-羟基5-羟基12-羟基7-羟基11-羟基16-羟基7,16-二羟基1,7-二羟基1,12-二羟基3-表-7-羟基第三十七页，共七十五页，2022年，8月28日脂蟾毒配基的微生物转化

选择细孢毛霉MucorsubtilissimusAS3.2454制备转化脂蟾毒配基11-羟基12-羟基16-羟基1,11-二羟基1,12-二羟基12,16-二羟基12-O--D-葡萄糖苷第三十八页，共七十五页，2022年，8月28日（五）大黄蒽醌类

蓼科掌叶大黄RheumpalmatumL.

唐古特大黄

R.tanguticumMaxim.ExReg.

南大黄R.officinaleBaill.的根状茎产于四川、甘肃、青海、西藏、宁夏、陕西、湖北、云南、贵州等地生用或酒制、蒸熟、炒黑用功效：泻下、健胃、清热、解毒富含的大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素，具致泻和抗菌作用刺囊毛酶Mucorspinosus对大黄酚、大黄素甲醚、大黄素具有转化作用蓝色梨头酶3.3389可以使大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素糖苷化第三十九页，共七十五页，2022年，8月28日大黄酚大黄素甲醚大黄素Mucorspinosus28℃5天Mucorspinosus28℃5天Mucorspinosus28℃5天Mucorspinosus28℃5天第四十页，共七十五页，2022年，8月28日（六）麻黄碱

又称麻黄素，l-麻黄碱和d-伪麻黄碱是麻黄的主要活性成分麻黄碱属拟肾上腺激动药治疗支气管哮喘、各种咳嗽、过敏反应、低血压等症还具有松弛平滑肌、收缩血管、加速心率、升高血压及中枢神经兴奋作用伪麻黄碱为拟交感神经药收缩上呼吸道黏膜血管作用与麻黄碱相当升压作用只及l-麻黄碱一半对心血管和中枢神经系统兴奋作用明显弱于麻黄碱加快心率、升高血压、中枢兴奋等不良反应较轻有显著的利尿作用

临床上治疗感冒如白加黑、新康泰克、银得菲、泰诺感冒片等治疗咳嗽如定喘宁胶囊、小儿止咳糖浆第四十一页，共七十五页，2022年，8月28日生产方式植物提取法直接化学合成法半生物合成法微生物直接转化法国内外报道很少丙酮酸脱羧酶CO2L-麻黄碱D-麻黄碱第四十二页，共七十五页，2022年，8月28日（七）延胡索素

罂粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang块茎的化学成分延胡索性微温，味辛，能和血散瘀、行气止痛具有镇痛、镇静、安定及催眠作用

对慢性持续性疼痛效果较好

对创伤及手术后疼痛作用较差主要有延胡索甲素、乙素、丙素、丁素、戊素、己素等延胡索乙素dl-tetrahydropalmatine,THP为优良的镇痛、镇静、催眠药物延胡索乙素THP第四十三页，共七十五页，2022年，8月28日Streptomycesgriseus左旋四氢帕马丁L-tetrahydropalmatine,L-THP左旋紫堇达明L-corydalmin,L-CDL第四十四页，共七十五页，2022年，8月28日

天然药物的酶法生物转化酶的特性：加快反应速度降低反应活化能不改变反应性质反应前后数量和性质不变催化效率高酶催化比非酶催化快106-1012

催化剂用量少专一性强作用的底物和催化反应都是高度专一的反应条件温和

pH5-8温度20-40℃

酶的催化活性受到调节和控制第四十五页，共七十五页，2022年，8月28日一酶生物转化的方式（一）酶与底物的结合方式

1.酶与底物多点结合

2.酶-底物络合物的形成和分解

3.分子内催化

4.静电催化

5.金属离子催化第四十六页，共七十五页，2022年，8月28日（二）反应的类型

1.氧化还原方式(oxidoreductase)催化底物分子发生电子迁移过程体内参与产能、解毒和某些生理活性物质的合成常需要辅酶NAD或NADP以及FAD或FMN参与，有的不需要辅酶参与

各种脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶和细胞色素氧化酶

2.转移基团方式(transferase)

催化功能团转移体内参与核酸、蛋白质、糖及脂肪的代谢和合成

转氨酶、糖基转移酶、羰基转移酶、酮醛基转移酶和酰基转移酶

3.水解方式(hydrolase)

降解作用来源丰富应用广泛

脂肪酶、糖苷酶和蛋白酶

4.裂解方式(lyase)

脱去底物上某基团留下双键或在双键处加入基团

5.异构体转化方式(isomerase)

生物代谢需要进行分子异构化

外消旋、差向异构、顺反异构、醛酮异构、分子内转移和分子内裂解

6.连接方式(ligase)

关系很多生命物质的合成如脂酰CoA合成酶第四十七页，共七十五页，2022年，8月28日二酶生物转化的调节（一）转化的时间和温度（二）转化的pH（三）转化体系中的水含量（四）有机溶剂对酶转化的影响（五）激活剂和抑制剂对酶转化的影响（六）表面活性剂对酶转化的影响（七）射线对酶反应的影响（八）超声波对酶反应的影响第四十八页，共七十五页，2022年，8月28日三天然药物酶法生物转化（一）紫杉醇Streptomycessp.MA7065羟基化紫杉醇第四十九页，共七十五页，2022年，8月28日水解反应sinenxanA可水解稳定MicrosphaeropsisonychiuriMucorsp.10-deacetyl-7-epitaxol10-deacetylbacctinⅤ第五十页，共七十五页，2022年，8月28日酰化反应C.echinulata10-deacetylbacctinⅢbacctinⅢ第五十一页，共七十五页，2022年，8月28日（二）皂苷类人参皂苷

三萜皂苷分为三类：二醇型如Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rh2

三醇型如Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1

齐墩果酸型如R0，Rh3

人参皂苷没有化学合成的，从人参植株或愈伤组织提取人参稀有皂苷包括Rh1，Rh2，Rh3，Rg1，Rg3，Rg5

人参稀有皂苷具有很高的生理活性抗癌软化血管和抗癌ReRg1人参皂苷--鼠李糖苷酶Rha第五十二页，共七十五页，2022年，8月28日Rg5Rg3Rh2Rh3二醇类皂苷第五十三页，共七十五页，2022年，8月28日白头翁皂苷

毛茛科白头翁属白头翁PulsatillachinensisRegel的干燥根性寒味苦，具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫的功效主要有效成分为三萜皂苷及毛茛苷

抗癌

抗黑色素瘤白头翁皂苷Ⅲ白头翁皂苷Ⅴ白头翁皂苷Ⅳ得率44%得率4.08%第五十四页，共七十五页，2022年，8月28日（三）黄酮类大豆异黄酮

有12种异构体，分为游离型和结合型苷元占总量2-3%，糖苷占总量的97-98%染料木苷染料木素第五十五页，共七十五页，2022年，8月28日异槲皮苷

植物界分布较广，芦丁的衍生物具有抗氧化剂的特异性质人体老化和疾病发生芦丁在自然界含量十分丰富，槐花中高达28%

异槲皮苷含量极低，万分之一或十几万分之一

利用酶法将芦丁水解转化为异槲皮苷的研究具有广阔的前景芦丁--鼠李糖苷酶Rha芦丁异槲皮苷第五十六页，共七十五页，2022年，8月28日新橙皮苷二氢异黄酮

新橙皮苷是柑橘皮类含有的黄酮类化合物，苦味新橙皮苷二氢查耳酮，甜度是蔗糖的1000倍，是高甜度、无热量、无毒、安全的甜味剂缺点：溶解度低+第五十七页，共七十五页，2022年，8月28日（四）红景天苷

抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等明显功能具有增强注意力、提高工作效率、延缓机体衰老、防止老年疾病等功效医药工业和食品工业最有发展前途红景天苷是合理开发利用红景天植物资源的重要指标最优条件：温度45℃，pH5.0，反应时间6h，酪醇15g/L，葡萄糖60g/L第五十八页，共七十五页，2022年，8月28日

天然药物的植物细胞法生物转化一概述（一）植物细胞培养的基本概念

细胞:细胞是生命结构和功能的基本单位，是生命活动的基本单元。组织培养:无菌条件下，利用植物离体器官（根、茎、叶、花、果实和种子等）、组织（如花药组织、胚乳和皮层等）或细胞（包括原生质体），在适宜的人工培养基上进行培养，在一定的培养条件诱导下，使其产生愈伤组织、芽或者发育形成小植株的一种实验技术。细胞培养:在离体培养条件下，将愈伤组织或其他易分散的的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到游离状态的悬浮细胞，然后通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体或产物的一种技术。第五十九页，共七十五页，2022年，8月28日（二）植物细胞培养方法1.外植体的选择

2.愈伤组织诱导

3.细胞的选育与诱变

4.培养基

5.培养方法第六十页，共七十五页，2022年，8月28日二植物细胞生物转化的主要反应类型（一）羟基化反应（二）糖基化反应（三）氧化还原反应（四）水解反应第六十一页，共七十五页，2022年，8月28日三植物细胞生物转化系统（一）悬浮细胞（二）固定化细胞转化系统（三）发根转化系统第六十二页，共七十五页，2022年，8月28日四植物细胞生物转化的调节（一）植物细胞的影响（二）外源底物的影响（三）培养条件的影响第六十三页，共七十五页，2022年，8月28日五天然药物的植物细胞生物转化（一）紫杉烷类化合物sinenxanA

银杏悬浮细胞

C6羟基化；C9羟基化、甲酰化、选择性乙酰化；

C10脱乙酰基、甲酰化；C14脱乙酰基桔梗悬浮细胞

C10脱乙酰基长春花悬浮细胞第六十四页，共七十五页，2022年，8月28日10-deacetylbacctinⅢbacctinⅢ2-debenzoyltaxol紫杉醇

桉树悬浮细胞第六十五页，共七十五页，2022年，8月28日（二）鬼臼毒素类化合物coniferylalcohol(+)-pin