土壤微生物分离纯化及鉴定

EM原液中细菌的计数、分离纯化、形态分析及鉴定【摘要】此次实验通过稀释涂布、划线分离等微生物实验的基本操作方法，对EM菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，肠杆菌属，葡萄球菌属等几种细菌的菌种。【关键词】细菌，稀释涂布，分离纯化，形态分析，鉴定。【前言】此次实验从EM原液中分离得到芽孢乳杆菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，肠杆菌属，葡萄球菌属等几种细菌。EM菌（EffectiveMicroorganisms）为有效微生物群的英文缩写，也被称作EM技术。它由光合细菌、乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、醋酸菌、双歧杆菌、放线菌七大类微生物中的10属8020世纪70消除腐败，抑制病原菌，形成良好的生态环境。在种植、畜牧、水产、环保、饲EMEM(regeneration)，消极微生物（分解，退化(decomposition,degeneration)）以及机会主义微生物。在不同的环境中（水，土壤，空气或人的肠道EM巴西、法国、台湾等90多个国家和地区。EM材料与方法材料EM菌原液（EffectiveMicroorganisms）试剂：革兰氏染色用卢戈氏碘液，结晶紫染

液，95%乙醇，0.5%番红染液，5%孔雀绿染液，0.1%吕氏碱性美蓝染液。仪器和其他用品：玻璃珠，量筒，玻璃棒，天平，pH试纸，高压蒸汽灭菌锅，电热套，载玻片，盖玻片，镊子，接种环，酒精灯等。方法实验准备准备实验所需仪器与药品，按照配方10g氯化钠(NaCl)5g1000mlLB培养基。pH7.0。并对仪器和培养基进行灭菌。1.2..2梯度稀释无菌操作，移取1mlEM带玻璃珠的无菌90mL无菌水的三角瓶中，充分摇匀20min，将菌分散。1910-310-4、10-5、10-6倍浓度的梯度稀释液。1.2.2.3分别从10-410-510-6倍的1毫升菌液，注入培养皿内，用三336℃2经过一定时间培养后，观察并记录菌落形态特征。1.2.3计数对平板上的菌落数量进行计数。同一梯度取三个平板菌落数的平均值。1.2.4划线分离从平板中挑取单个细菌菌落，注意选择形态特征有明显差异的菌落。在LB培养基上进行划线分离。结果与分析结果

1.2.5斜面接种保藏菌种无菌操作，从画线后的培养基上挑取单个菌落，在准备好的试管斜面上划线接种。斜面置于36℃恒温箱中培养。1.2.6观察与鉴定1.2.6.1观察：取分离出的细菌菌种制3用高倍镜观察并记录细菌的形态特征。1.2.6.2细菌大小的测量先校正目镜测微尺，计算出目镜测微尺每格所代表的长度。将细菌制成美并记录。1.2.6.3细菌的革兰氏染色对分理出的菌种分别进行革兰氏染1-21溶液。用乙醇（95%）20-30干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。1.2.6.4细菌芽孢染色按常规方法涂片、干燥、固定，滴加孔雀绿染液，用酒精灯加热染色，倾去染液，水洗至不褪色为止，用0.5%番红水溶液复染2min水洗至流出水无色。镜检。稀释倍数及菌落数EM原液中含有的细稀释倍数及菌落数EM原液中含有的细cfu/ml10-410-510-6菌群落总数cfu/ml（取两位有效数字）1842642376893029252543332.5x106平均83284表1-2：菌落形态的观察记录菌落编号1号2号3号4号5号菌落直径/mm1~23~42~32~32~3菌落形态圆点圆点圆点圆点圆点菌落是否突起是是是是是菌落颜色乳白白色白色白色黄色菌落边缘均匀均匀均匀光滑均匀菌落干湿半湿半湿干燥半湿半湿菌落是否透明否否否否否图1：第1、3、5号菌落图示表1-3：细菌大小测定记录大膨大大膨大菌落编号12345试管编号12345678910长度/μm1.5289341.20.80.50.7宽度/μm111.20.30.50.40.40.50.7试管编号12表1-4：3染色结果记录4 5 6789 10革兰氏染阳性阳性阳性阳性色结果芽孢染色圆形芽孢芽孢居中卵圆形芽无芽孢无芽孢结果居中不膨不膨大孢在顶端图2 2号试管菌种的革兰氏染色结果 图3 8号试管中菌种的革兰氏染色结果 图4号试管菌种的革兰氏染色结果 图5 6号试管菌种的芽孢染色结果菌种鉴定2Sporolactobacillu3456号为梭菌属（Clostridia，7、8号为肠杆菌属（Enterobacte）9、10号为葡萄球菌属（Staphylococcu。无法具体鉴定到种。实验结果总结各属细菌特点：芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillu：直杆菌，0.7～0.8μm×3～5μm。单个，成对，罕见短链。革兰氏染色呈阳性，以周生鞭毛运动。芽孢产生稀少，D-Bacillu0.5～2.5μm×1.2～10μm以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。每个细胞pH和盐各种多样性的生理特性。化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型。梭菌属细胞杆状，0.3～2.0μm×1.5～2.0μm，常排列成无机化能营养。可以水解糖、蛋白质，或两者都无或两者皆有。肠杆菌属细胞直杆状，宽0.6～1.0μm×1.2～3.0μm，4～6CO2∶H2=2∶1)。在44.5℃时不能由葡萄糖产气。大多数菌株VP试验阳性，MR试验阴性。最适生长温度为37℃37℃广泛分布于自然界，普遍存在于人和动物中。葡萄球菌属（Staphylococcu：因排列成葡萄串状而得名。单个或成双存0.5～1.537℃,多数菌株能产生脂溶性色素,DNA中的G