《分子生物学》研究生课件ln-蛋白质的修饰与降解

第二章

蛋白质的修饰与降解第一节蛋白质的修饰

蛋白质的翻译后修饰指对蛋白质进行共价加工的过程，可调节蛋白质的活性、定位、折叠、以及蛋白蛋白相互作用。磷酸化脂基化甲基化乙酰化糖基化SUMO化巴豆酰化一、磷酸化磷酸化去磷酸化催化磷酸化的蛋白激酶

蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶PKAPKCPKG

蛋白质酪氨酸激酶PTK

非受体型Src

受体型EGFRIGFRPDGFR

双专一性蛋白激酶DSPKWeelERK1EKR2cAMP激活PKA影响糖代谢示意图调节基因表达

调节细胞极性

PKA亦可通过磷酸化作用激活离子通道，调节细胞膜电位。2.IP3/DAG-PKC通路促甲状腺素释放激素、去甲肾上腺素、抗利尿素与受体结合后所激活的G蛋白可激活PLC。PLC水解膜组分PIP2，生成DAG和IP3。IP3促进细胞钙库内的Ca2+迅速释放，使细胞质内的Ca2+浓度升高。Ca2+与细胞质内的PKC结合并聚集至质膜。质膜上的DAG、磷脂酰丝氨酸与Ca2+共同作用于PKC的调节结构域，使PKC变构而暴露出活性中心。PKCsignaling激素EGFR介导的信号转导过程催化蛋白质去磷酸化的蛋白磷酸酶蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶

PP1、PP2A、PP2B、PP2C蛋白质酪氨酸磷酸酶

1/3是跨膜的，类似受体

2/3是游离于胞质，为非受体型二、脂基化为长脂肪链通过O或者S原子与蛋白质缀合的过程，通常是蛋白质分子的半胱氨酸残基被棕榈酰化或者法呢基化。铜蓝蛋白Leu-Ala-Gly-Cys分别催化的酶是棕榈酰基转移酶法呢基转移酶三、甲基化S-腺苷甲硫氨酸提供甲基集团甲基转移酶

组蛋白LysArg四、乙酰化乙酰基乙酰基转移酶主要Lys组蛋白的乙酰化调控基因转录调控自噬

调节代谢酶的活性五、类泛素化--SUMO化(smallubiquitinrelatedmodifier)小泛素相关修饰物，分子结构类似泛素E1活化酶、E2结合酶、E3连接酶SUMO的C-端Gly残基和底物蛋白Lys的-氨基间形成一个异肽键SUMO的C-末端短肽切除，暴露出Gly-Gly模特序列，使其变成成熟的功能蛋白去SUMO化Ulp蛋白质SUMO化UlpUlp蛋白质SUMO化SUMO化修饰的生物学作用底物多为转录调节因子或共调节因子参与维持基因组的完整性及调节染色体的凝集与分离参与DNA修复拮抗泛素作用调节蛋白的核质转运和信号转导六、巴豆酰化巴豆酰基巴豆酰基转移酶组蛋白Lys基因活化七、不同翻译后修饰相互协调与影响细胞信号转导过程中存在多种蛋白翻译后修饰一种蛋白质可以有一种以上的翻译后修饰八、研究策略放射性跟踪修饰性抗体技术质谱技术第二节

蛋白质的降解

细胞内的蛋白质分子处于一动态平衡过程中。进行自我更新。蛋白质降解途径：

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome

system,UPS）自噬溶酶体（autophagy-lysosome）系统蛋白质分子降解的生理功能：

1、清理不正常蛋白质的管家功能

2、破坏正常蛋白质的调节功能细胞内成分的主要降解途径1、蛋白酶体途径：降解细胞内短寿(short-lived)、多聚泛素化(ubiquitination)的蛋白质。原核生物：通过19S的蛋白酶体能识别靶蛋白的特定氨基酸序列并将其降解。真核生物：则是通过26S的蛋白酶体降解蛋白质。2、内吞途径：将跨膜蛋白运送到溶酶体降解。3、细胞自噬途径：而长寿蛋白(long-livedprotein)、蛋白聚集物及膜包被的细胞器是通过细胞自噬的方式在溶酶体降解。一、UPS（ubiquitin-proteasomesystem）组成

20S核心颗粒蛋白酶体激活因子

19S、11S、PA200分类

ATP和泛素依赖的UPS-19S

不依赖ATP和泛素的UPS-11S

降解变性和错误折叠的蛋白质泛素76个氨基酸的小分子蛋白(8.5kD)普遍存在于真核生物而得名一级结构高度保守蛋白质的泛素化主要发生在赖氨酸残基的侧链，且通常是多泛素化。结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别进而被降解，泛素相当于蛋白质被降解的标签。1.泛素化(ubiquitination)

泛素与选择性被降解蛋白质形成共价连接，并使其激活。(赖氨酸)2.蛋白酶体(proteasome)对泛素化蛋白质的降解泛素介导的蛋白质降解过程泛素化过程E1：泛素活化酶E2：泛素携带蛋白E3：N-去稳定残基识别蛋白泛素CO-O+HS-E1ATPAMP+PPi泛素COSE1HS-E2HS-E1泛素COSE2泛素COSE1被降解蛋白质HS-E2泛素COSE2泛素CNH被降解蛋白质OE3带有成串泛素分子的底物蛋白再被26S蛋白酶复合体识别蛋白酶复合体分子量极其巨大在蛋白酶复合体腔中，蛋白质被水解TheoncoproteinSS18-SSX1promotesp53ubiquitinationanddegradationbyenhancingHDM2stability.TransfectionExampleMolCancerRes.2008Jan;6(1):127-38.稳定残基:半胱、丙、丝、苏、甘、缬、蛋肽链内部的保守序列：PEST使蛋白质分子短命----UPS识别信号去泛素化酶（deubiquitinatingenzyme，DUB）如周期蛋白，基因表达、细胞增殖、炎症反应、诱发癌瘤（促进抑癌蛋白P53降解）蛋白浓度的周期性降低正是泛素介导的蛋白酶复合体作用的结果。体内蛋白质降解参与多种生理、病理调节作用二、自噬溶酶体系统什么是自噬？

自噬（autophagy）是真核生物进化过程中高度保守一类降解途径，通过形成双层膜的自噬体，将蛋白质等生物大分子或细胞器（线粒体等）回收至溶酶体将其降解为氨基酸、单糖等小分子，实现循环再利用。

自噬体的半衰期8min左右，是细胞对于环境变化的有效反应。自噬性细胞死亡,是凋亡和坏死之外的第三种程序性细胞死亡方式.

细胞自噬的分类1、巨型细胞自噬

(macroautophagy)，又称为大自噬，是指细胞内新生的球状脂质双层包裹胞浆蛋白和细胞器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。2、微型细胞自噬

(microautophagy)，又称为小自噬，是指通过溶酶体膜的内陷、突起和/或分隔，直接吞入细胞浆的自噬行为。3、分子伴侣介导的细胞自噬(chaperonemediatedautophagy，CMA)，是指由分子伴侣将靶蛋白转送至溶酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。——根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同AutophagyAutophagyisacellulardegradationsysteminwhichcytoplasmiccomponents,includingorganelles,long-lifeproteinaresequesteredbydouble-membranestructurescalledautophagosomesandthesequesteredmaterialsaredegradedbylysosomal

hydrolases

ControlStarvation基础自噬：是一种在大多数细胞中持续发生而水平相对较低的细胞自噬过程,对细胞内物质的更新及细胞内环境稳态的维持具有不可或缺的作用。诱导自噬：是细胞应对外界刺激的一种保护反应。缺少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下,细胞的自噬水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬过程。

如哺乳动物出生后初期,由于母体不再提供营养来源,幼体的细胞自噬非常活跃,这为维持其生命活动起了非常重要的作用。基础自噬和诱导自噬自噬进程1、自噬的诱导激活2、自噬体的成核和延伸3、自噬体与溶酶体融合4、内容物降解第一步：自噬的诱导一系列自噬相关基因（autophagy-relatedgene，Atg）组成的复合体参与调控自噬体的形成。主要是Atg1/ULK1复合体，包括Atg1、Atg13、Atg17,mTORC1磷酸化Atg1/ULK1和Atg13抑制自噬的起始。mTORC1失活自噬激活ULK1去磷酸化Atg7-Atg3-induction第二步：自噬体的成核，细胞在接受自噬诱导信号后，在胞浆中形成一个小的膜样结构:分离膜(isolationmembrane，IM)，然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为前自噬体(pre-autophagosomePAS)，是自噬发生的标志之一。需要Atg6（Beclin1）-ClassⅢPI3K

复合体以及Atg12-Atg5-Atg16L复合体.形态特点：自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结构，两层膜之间有腔。随着自噬前体增大和包裹内容物，内腔变得不明显。多种ATG蛋白参与自噬前体的组装。组分来源：来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质网或高尔基复合体等膜结构。Atg7-Atg3-induction第二步：自噬体膜的延伸，自噬前体在两个类泛素系统作用下，包括Atg12-Atg5-Atg16L复合体和LC3(Atg8)作用下，LC3不断接受PE，扩展膜的长度，成为成熟的闭合自噬泡。形态特点：自噬前体由半月形，不断延伸成闭合的完整的双层膜结构的圆形自噬泡，内容物为不断捕获的待降解的衰老的蛋白、细胞器、蛋白聚集体。Atg7-Atg3-第三步：自噬体与溶酶体的融合，被运送到溶酶体，两者的生物膜融合，变成一个自噬溶酶体(atuolysosome)。形态特点：多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解，在透射电镜下自噬溶酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。第四步：自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物，成为降解性自噬体(degradative

autophagicvacuole)。①自噬的诱导②自噬体的成核和延伸③自噬溶酶体的形成④内容物的降解自噬的调节1、mTOR活性调节2、胰岛素（激活mtor；抑制FoxO3）自噬调控的中心分子TOR(targetofrapamycin)

雷帕霉素作用的靶位点(Tagetofrapamycin,TOR)是氨基酸、ATP和激素的感受器,它在调节细胞生长和自噬的发生过程有重要作用。

TOR(targetofrapamycin)能感受细胞的多种变化信号,加强或降低自噬的发生水平。细胞内ATP水平、缺氧等细胞信号都可直接或间接通过TOR将其整合,从而改变细胞的自噬发生,应对不同的外界环境刺激。

Atg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,哺乳动物中同源蛋白ULK1,ULK1以复合物的形式存在,除了ULK1本身,还包括mAtg13、FIP200(一种与黏着斑激酶FAK相互作用的蛋白)和Atg101。Atg1/ULK1蛋白激酶复合体

当营养足够时,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)与Atg1/ULK1复合物与结合,通过磷酸化Atg1/ULK1和ATG13从而抑制自噬的起始从而抑制自噬。

在饥饿的条件下,mTORC1从Atg1/ULK1复合物上分离,从而诱导自噬体的成核(Nucleation)和延伸(Elongation)。AMPK是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶,在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用。低ATP水平状态下(如饥饿或缺氧)AMPK能感受AMP的水平变化而激活,从而磷酸化结节性硬化复合体TSC2(tuberoussclerosisprotein)加强TSC1/2对Rheb的抑制,最终使mTOR的活性被抑制,诱导细胞发生自噬。AMPK(AMP-activatedproteinkinase)Atg9是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的Atg基因,能通过影响膜泡运输对自噬发生起调控作用。营养物质缺乏时,Atg9与Atg23、Atg27结合,将它们运输至PAS;Atg9/mAtg9在Atg5-Atg12-Atg16连接系统中,首先由Atg7(E1)活化Atg12;然后将Atg12传递给类Atg10（E2）最后,Atg12被传递到Atg5,与Atg5的Lys共价结合形成Atg12-Atg5复合物。自噬发生时,Atg16和Atg12-Atg5结合，Atg16含有一个螺旋卷曲结构易于形成低聚物,使得其能把更多的Atg12-Atg5连接起来形成巨大复合物。从而可能为参与自噬泡形成的蛋白质提供相互作用的平台。自噬发生时,此复合物定位于隔离膜上,参与LC3-II的形成过程,从而促进自噬泡膜的延长。自噬发生过程中有两组类泛素化修饰过程,分别发生在Atg5-Atg12-Atg16连接系统和Atg8/LC3连接系统中,用于隔离膜的延长和自噬泡的形成。Atg5-Atg12-Atg16复合物Atg8/LC3LC3：是酵母Atg8分子在哺乳动物中的同源物，是自噬发生的一个标志蛋白。功能：促进自噬泡膜的延长和融合,是自噬泡形成所必需的。

LC3合成后,最初以pro-LC3形式存在,然后立刻被Atg4B切割形成LC3-I。自噬发生时,均匀分布于细胞质中的LC3-I被Atg7（E1）活化并与其形成硫酯键,然后被传递给Atg3（E2）,并最终在Atg5-Atg12-Atg16复合物（E3）的帮助下连接上一个PE分子,形成具有膜结合能力的LC3-II。Atg16L的细胞定位决定了LC3成熟的位置,并促进LC3-II结合到自噬泡上。自噬小泡的成核需要含有ATG6(其哺乳动物同源蛋白命名为Beclin1)的复合物,这个复合物能够与第三类磷酸肌醇3激酶VPS34形成超级复合物并使其激活产生磷脂酰肌醇3磷酸。PI3P可以组装一些含有PX和FYVE结构域的蛋白质到早期自噬泡产生的位置,促使自噬前体的形成。ATG6/Beclin-1Vps34是哺乳动物中的第III类PI3K。在Vps34复合物中,Vps34因结合Vps15而被激活,并进一步结合Beclin1形成Vps34-Vps15-Beclin1复合体。功能：自噬发生时,Vps34-Vps15-Beclin和多种自噬相关蛋白结合,传递自噬信号促进自噬发生。Vps34/PI3K-Beclin1复合物1、

如与Atg14结合形成Atg14-Vps34-Vps15-Beclin1复合物参与自噬泡的形成;2、与VRAG结合形成VRAG-Vps34-Vps15-Beclin1在自噬泡成熟和运输中起作用。3、

促进产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P),PI3P可以组装一些含有PX和FYVE结构域的蛋白质到早期自噬泡产生的位置,促使自噬前体的形成。自噬的分子机制mTORC1：哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白复合物1Atg12/LC3：两种泛素样加工系统，包裹自噬底物形成自噬体。Atg12-Atg5-Atg16L1:与外膜结合，促进伸展Atg5:决定膜伸展方向LC3-Ⅱ：自噬体标志分子，判断诱导或抑制Atg9:嵌膜蛋白来回循环移动活化该激酶复合物从而产生自噬分隔膜。PE:磷脂酰乙醇胺Physiologicalandpathologicalrolesofautophagy1、应激功能细胞自噬是细胞在饥饿条件下的一种存活机制。在营养充足条件下，自噬发生处于较低水平，仅在胞质中去除受损和多余的细胞器以维持细胞内环境稳定，称为基本自噬。细胞营养缺失时，细胞立即启动自噬以维持胞质中氨基酸池的平衡，可通过合成新的蛋白质、能量生成和促进糖异生来避免细胞“饿死”。自噬的生物学意义2、防御功能在细胞受到致病微生物感染时，细胞自噬起一定的防御作用。某些细菌和病毒可逃离异噬途径，避免溶酶体消化。李斯特菌属、志贺杆菌属、立克次体属等的细菌可通过降解异噬体膜逃入细胞质。细胞能够通过自噬发挥先天性免疫作用，抵抗细菌入侵。结核杆菌通常定居于异噬体内，但可激活自噬途径被溶酶体酶杀死。自噬也可以将病毒核酸转运至胞内感受器上激活天然免疫，还可以将病毒抗原递呈给ＭＨＣ类分子激活适应性免疫，发挥抗病毒作用。4、延长寿命细胞自噬可降解损伤的细胞器、细胞膜和变性蛋白等胞内成分。如果细胞自噬受损衰竭，细胞损伤就会堆积、累加，产生老化。

长期减少热量摄入，在一些物种能延长寿命。3、维持细胞稳态在骨骼机和心肌，细胞自噬有特殊的“看家”(housekeeping)功能，帮助细胞浆成分，包括线粒体，进行更新。自噬样细胞死亡（autophagiccelldeath，ACD）：

在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）,核破裂、细胞皱缩、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞死亡，它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为TypeIIcelldeath，相应的，凋亡为TypeIcelldeath，坏死为TypeIIIcelldeath。

尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是自噬引起死亡还是死亡时有自噬发生，但不是直接原因？5、参与控制细胞死亡及癌症自噬在肿瘤发生中的双重作用，在多种人类肿瘤中均存在自噬活性的改变。一方面，自噬可抑制肿瘤的发生:

首先，自噬可清除受损细胞器以避免有害的氧自由基蓄积及突变的发生。其次，自噬可限制DNA损伤，维持基因组完整性。在永生化鼠肾上皮细胞中自噬活性降低可导致细胞DNA损伤，基因扩增，染色体非整倍性，从而增加了致癌性突变率，促进了肿瘤的发生。再次，自噬可抑制细胞生长，诱发凋亡性细胞死亡。细胞自噬与肿瘤另一方面，自噬通过限制细胞坏死和炎症促使肿瘤细胞存活于代谢性应激的环境中，这些肿瘤细胞所具有的高自噬活性能增强肿瘤对应激的适应性，对肿瘤细胞在恶劣环境中的生存起到了一定的保护作用。当快速生长的肿瘤细胞缺乏营养时，实体肿瘤内部血供不良，癌细胞利用自噬机制对抗营养缺乏和缺氧，通过降解胞内蛋白质及细胞器为肿瘤细胞的生长提供营养及能量，可能利于肿瘤细胞在低血管化的环境中生长。自噬检测技术1自噬性结构的电镜下形态学观察----------电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构

电镜下可观察到双层膜的自噬体和单层膜的自噬溶酶体结构,其中包裹着未被完全降解的胞浆成分。初始自噬囊泡(Avi)降解自噬囊泡(AVd)缺点：电镜观察仅能证明自噬性结构的存在，难以反映自噬活性的强弱。2基于自噬体标记蛋白LC3的检测方法微管相关蛋白1轻链3(LC3),LC3-Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记，

2.1通过构建绿色荧光蛋白(GFP)和LC3的融合蛋白,通过荧光显微镜就可观察LC3在细胞中的定位。通过免疫荧光的方法检测内源性LC3或转染GFP-LC3融合蛋白的表达，自噬诱导后的细胞表现为点状聚集增．理论上，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况。可以从总体上大致反映自噬的增加或减少

除了荧光显微镜观察LC3外,LC3还是生化方法检测自噬体的有利工具。内源性LC3-II的量在某种程度上可反映细胞自噬活性。因此,通过免疫印记方法检测LC3-II信号的强弱来对哺乳动物细胞自噬活性进行定量检测。

2.2LC3-Ⅱ的水平在某种程度上反映了自噬体的多少ControlStarvationXdepletionpromotes

autophagy

Si-XcontrolStarvationLC3p62β-actinStarvation++--XKnowdownMock

XNutrientLC3

GFP-LC3切割LC3连同自噬体内膜和内容物一起被溶酶体降解，但GFP在溶酶体中仅表现荧光信号猝灭，GFP本身并不被降解，在自噬性溶酶体降解后会释放出游离的GFP．有鉴于此，通过免疫印迹的方法检测游离GFP蛋白的出现即意味着自噬性降解的发生。GFP2.3GFP-LC3剪切分析3基于自噬性降解的检测———“自噬潮”分析自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。3.1长寿命蛋白降解根据自噬机制主要负责降解长寿命蛋白的特性，先让细胞在含有同位素标记氨基酸的培养基中生长一段时间(数小时至数天)，细胞在此期间合成的蛋白质都将被同位素标记，然后换成不含同位素的培养基，让一些被标记的短寿命蛋白通过蛋白酶体途径降解．

在自噬诱导后，通过检测培养上清中释放的自噬性降解产物的放射