2. 柠檬酸发酵培养基

实验一双酶法制备淀粉糖综合实验一面包酵母高

密度发酵实验实验一双酶法制备淀粉糖一、实验目的1、了解淀粉糊化及酶法制备淀粉糖浆的基本原理。2、掌握淀粉双酶法制备淀粉糖浆的实验方法，以及酶的使用。淀粉的组成由D-葡萄糖单体组成的同聚物。包括直链淀粉（α-1,4-糖苷键）和支链淀粉两种类型。（α-1,4-糖苷键，α-1,6-糖苷键

）

淀粉颗粒麦芽、辅料中的淀粉，一般由细胞壁包围，以颗粒状存在。这种颗粒不溶于水，也不受淀粉酶的作用。PotatostarchWheatstarch糖化中的淀粉分解

淀粉的糊化、液化、糖化糊化是指淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性的淀粉糊，这一过程称为糊化。简而言之，糊化就是淀粉颗粒在热溶液中膨胀破裂的过程。液化是指利用液化酶将糊化淀粉水解成糊精和低聚糖小分子等，使粘度降低，流动性增高。糖化是指利用利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为“糖化”。DE值DE值即葡萄糖值，用以表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是葡萄糖占干物质的百分率，即：二、实验原理——淀粉的糖化许多微生物不能直接利用淀粉，除分泌胞外淀粉酶微生物外。淀粉水解葡萄糖，才能被酵母菌利用。酸解法酶解法酸酶（或酶酸）结合法酸酶法酶酸法淀粉糖化的方法1.酸解法淀粉酸高温高压葡萄糖2.酶解法（双酶法）淀粉a-淀粉酶糊精和低聚糖糖化酶葡萄糖(液化)（糖化）

3.酸酶法淀粉酸解法糊精和低聚糖糖化酶葡萄糖4.酶酸法淀粉a-淀粉酶糊精和低聚糖酸解法葡萄糖双酶法制备淀粉糖酶法糖化投资少，工艺稳定，对设备要求也不高，产品质量好，消耗小，收率高，条件温和，对环境影响小。

三、试验材料

玉米淀粉、液化型α-淀粉酶（酶活力6000单位/g），糖化酶（葡萄糖淀粉酶、酶活力为4-5万单位/g），10%NaOH,5%Na2CO3,5%CaCl2。500ml烧杯，pH试纸、秒表，玻璃棒，恒温水浴锅，电炉，石棉网、温度计、恒温水浴、手持糖度仪（可溶性固形物）。四、方法和步骤1、双酶法生产淀粉糖浆工艺流程50g淀粉（加水200ml，搅拌均匀）——淀粉浆——5%碳酸钠调节pH≈6.2-6.3——2ml5%CaCl2溶液——90-95℃水浴上加热（不断搅拌）——淀粉糊化——加入液化型α-淀粉酶60mg（不断搅拌）——液化——70-80℃搅拌20分钟，（取样分析DE值——至电炉（隔石棉网）加热到95℃至沸，灭活10分钟——过滤，滤液冷却至55℃——加入糖化酶200mg——调节pH≈4.5,于60-65℃恒温水浴中糖化3-4小时，（3小时取样分析控制DE≈42）即为淀粉糖浆。2、检测用手持糖度计测定，直接读取固形物含量。（3）糖化过程中DE值的变化实验二、面包酵母活化和种子液培养试验材料

面包酵母、葡萄糖、酵母浸膏、牛肉膏、氯化钠、试管（10×150mm）、培养皿、烧杯（500mL）、锥形瓶（300mL）、接种环、酒精灯、牛皮纸、pH试纸、恒温摇床、培养箱、离心机、生物安全柜、血球计数板、光学显微镜、盖玻片配制培养基（1）制备平板分离培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，琼脂20g，水1000mL。灭菌115℃，20min。每三角瓶分装100mL，灭菌后倒平板。（2）制备斜面保藏培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，琼脂20g，水1000mL。灭菌115℃，20min。每试管分装5mL，灭菌后摆斜面待用。（3）制备种子培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g,水1000mL。灭菌115℃，20min。每三角瓶分装30mL，灭菌待用。1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂20.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0。培养基的配制

培养基的制备过程

称量---溶解----调节pH值----过滤----分装及包扎----灭菌----灭菌后试管摆放斜面2.溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。3.调节pH值用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和盐酸调节PH。4.过滤

用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。5.分装及包扎根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。6.灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。7.灭菌后试管摆放斜面注意事项1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2；5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。返回2、平板分离称取0.1g即发性干酵母，转移至无菌水试管，振荡5min，制成菌悬液。划平板，30℃培养2d。用接种环沾取单菌落，划斜面，30℃培养30h。3、种子培养无菌条件下，用接种环挑取斜面上菌落，接种至种子培养基。30℃，150r/min，培养30h。血球计数板测种子培养液中酵母菌体密度。（三）平板划线分离法交叉划线法连续划线法（一）实验目的（二）实验原理（三）实验器材（四）实验方法（五）实验作业微生物数量的测定实验二（一）实验目的1、了解显微镜计数的原理；2、学习并掌握使用血球计数板进行微生物直接计数的方法。（二）实验原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板是一块特制的载玻片，其上四条纵槽构成了三个平台，中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分成9个大方格，中央的大方格为计数室。计数室边长1mm，共有400个小方格，加盖玻片于突起部分上时，即形成一个体积为0.1mm3的计数室。即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板。

在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400mm2。计数室通常也有两种规格：一种是16×25型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是25×16型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。1．16×25型的计数板含16中格，每中格有25个小格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（含100个小方格）计数计数重复3次，取其平均值。1ml菌液中的总菌数=100个小方格细胞总数A/100×400×10×

1000×稀释倍数B，或计数总数A／4×16×10×1000×稀释倍数B。即计数总数A×4×10000×稀释倍数B2．25×16型的计数板含25中格，每中格有16个小格。一般计数四个角和中央（1、5、13、21、25）的五个中方格（含80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均值。1ml菌液中的总菌数＝80个小方格细胞总数A/80×400×10×1000

×稀释倍数B，或计数总数A／5×25×10×1000×稀释倍数B。即计数总数A×5×10000×稀释倍数B（三）实验器材1.菌种

酿酒酵母（Saccharomyces

cerevisiae）菌悬液2.器具

显微镜、血球计数板、酒精灯、接种环、无菌水、吸管、盖玻片、计数器。（四）实验方法1.稀释

将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2.镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多）让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。4.显微镜计数

静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低倍镜找到计数室，再换成高倍镜进行计数，一般以每小格5—10个菌体为宜；每个计数室选右上右下、左上左下和中间的五个中方格中的菌体进行计数，每个样品重复计数两次5.清洗血球计数板

计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自行晾干或用吹风机吹干，镜检观察每小格内无残留物为止。

注意事项1、每天同一时间，各组取出本组的试管，用血球计数板计数酵母菌个数，并作记录，连续观察7天。2、从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀，防止酵母凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，求得的培养液中的酵母菌数量误差小。1、加样时先摇匀菌液，计数室中不可有气泡产生；3、如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，作为两个菌体计算；4、清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。5、对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数，一般可采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理，另两边不计数。计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数；如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。6、计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，对每个样品可计数三次，再取其平均值。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。按公式计算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌个数。

计数室各格中菌数

总菌数

稀释度菌数/ml平均值12345第一室第二室显微直接计数结果(五)、作业思考题：

1.用血球计数板计数时，哪些步骤易造成误差？

2.血球计数板测定原理是什么？它有那些原理？实验三面包酵母高密度发酵一、实验目的1、掌握面包酵母的发酵流程。二、实验原理

酵母高密度发酵技术是一种新型的生化工程技术，其产品在化工，食品，环保，医药等方面都存在极大的潜在能力。一般认为发酵液中酵母干重浓度达到30g/L以上，即为高密度发酵。三、试验材料

面包酵母、葡萄糖、酵母浸膏、牛肉膏、氯化钠、试管（10×150mm）、烧杯（500mL）、锥形瓶（300mL）、涂布棒、酒精灯、牛皮纸、pH试纸、恒温摇床、培养箱、离心机、生物安全柜、血球计数板、光学显微镜发酵培养基:

酪蛋白胨15g/L,酵母粉25g/L,葡萄糖30g/L,KH2PO42.4g/L,K2HPO4·3H2O16.34g/L高密度培养发酵培养基:蔗糖75g/L，酵母浸膏33g/L，蛋白胨16g/L，硫酸镁1.0g/L，K2HPO4·3H2O

3.4g/L，甘氨酸2g/L高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。高压灭菌锅压强指示指到0时才能打开灭菌锅。四、实验步骤

菌粉----分离纯化-----斜面保藏菌种------种子培养-----发酵培养（发酵培养基、高密度培养发酵培养基）1、取300mL锥形瓶，加入50mL发酵培养基，灭菌待用。2、种子液稀释10-3倍后，血球计数板计数。3、将种子液接入装有50mL发酵培养基的锥形瓶中，控制接种量使菌液初始细胞密度为5×105/mL。4、30℃、150r/min培养，每隔12h取样测定。五、结果与讨论实验四活性干酵母的制备一、实验目的1、掌握酵母细胞的一般提取方法、以及活性干酵母的制备方法。二、实验原理

发酵液的后处理包括离心、浓缩、洗涤、压榨或过滤。滤饼可挤压成半固体酵母块(含固形物30%),包装后作为鲜酵母使用。如果生产活性干酵母,可将压榨酵母挤压成细条状,采用快速低温干燥。在干燥过程中使用添加剂,以生产出稳定性极好的低水分的活性干酵母,而且减少活性的损失。活性干酵母含固形物大约为95%。对面包酵母培育的结果应使其色泽浅,富有生鲜气味。菌体细胞应各自分开,大小均一。三、试验材料

脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯

(乳化剂)离心管、烧杯。恒温摇床、培养箱、离心机、生物安全柜、血球计数板（全班4块）、光学显微镜（全班两台）、滤纸四、实验步骤

1、乳化剂用80～90℃的热水配制,可按每100mL水里加12.5g配制,配好后保持65～70℃,在抽滤之前加入酵母乳中(加入的百分比为酵母乳折干后的百分比)，采用2.0%的添加量并保证混合均匀。2、将发酵液离心并收集菌体，按上述比例加入乳化剂，抽滤后，切成小细条干燥（10oC烘箱烘干），收集后称重（干酵母净重=烘干后总重-烘干前滤纸重）。五、结果与讨论

1、活性干酵母成品的质量。2、活性干酵母的外观特征。六、思考题1、加入乳化剂的目的？柠檬酸发酵预实验一、预备实验：1.斜面培养基制备：PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂，PotatoDextroseAgar（Medium））：（马铃薯200克葡萄糖20克琼脂15~20克自来水1000毫升自然PH）。取PDA培养基粉约43g，加水至1000mL；121℃灭菌20min。

2.

柠檬酸发酵培养基：硝酸铵2.0g，KH2P041.0g，MgS040.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／LNaOH约2滴。取100ml上述培养液，加入500ml或300ml三角瓶中，包扎灭菌，待用。

1．菌种活化与种子的制备菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种黑曲霉，移至斜面培养基，经25~28℃斜面培养至孢子长好，作为活化后的种子（由实验员准备）。发酵用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养基，得到的培养物作为发酵用的种子。2．接种与发酵

取柠檬酸发酵培养基（液）3瓶，用接种环向每瓶接入黑曲霉孢子2~3环，26~28℃摇床培养5~7d，摇床转速120~150rpm，另1瓶不接种留作对照。今天实验安排1.配柠檬酸发酵培养基，每组400ml，分装4瓶，灭菌备用。2.酵母发酵培养和高密度发酵培养细菌密度（2组合用一组样品，分别测发酵和高密度发酵培养结果）、离心测上清液葡萄糖浓度（各组用自己的样品）。3.酵母离心收集、加乳化剂、抽滤、干燥、称重。4.接种黑曲霉孢子至柠檬酸发酵培养基（3瓶接种，1瓶不接种留做对照）。综合实验二柠檬酸发酵实验一些柠檬酸制品1.物理性质在室温下，柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗粒或白色结晶性粉末，无臭、味极酸，在潮湿的空气中微有潮解性。它可以以无水合物或者一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。加热到78°C时一水合物会分解得到无水合物。在15摄氏度时，柠檬酸也可在无水乙醇中溶解。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸C6H8O7也有含结晶水的柠檬酸2C6H8O7.H2O、C6H8O7.H2O或C6H8O7.2H2O。2.化学性质

化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。中文名称：

柠檬酸（

citricacid）化学名称：

2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸分子式：

C6H8O7

柠檬酸发酵微生物

1)

黑曲霉（Aspergillus

niger）的形态特征

2)

黑曲霉（Aspergillus

niger）的生理特征

黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能利用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。一、实验目的1、了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分析方法。2、通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的接种、培养与发酵产物的分析测定等技术。二、实验原理黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3为宜。用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌。在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸；柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。三、试验材料

1．菌种

黑曲霉斜面菌种

2．实验器材

0.1mol／L标准NaOH；0.1mol／LH2S04；展开剂：正丁醇：甲酸：水=40：55：5；

Deniges试剂(HgO1g溶于20ml0.2mol／LH2S04中)；酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；

18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；

碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广范pH试纸；pH酸度计；玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管，天平。层析缸（ø10cm×15cm）、毛细管(ø0.5mm)、玻棒、喷雾器、烘箱、尺、铅笔、干燥器，等。3.

柠檬酸发酵培养基：硝酸铵2.0g，KH2P041.0g，MgS040.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／LNaOH约2滴。取100ml上述培养液，加入500ml或300ml三角瓶中，包扎灭菌，待用。四、方法和步骤一、预备实验：1.斜面培养基制备：可用PDA培养基或其它霉菌培养基，用于霉菌的培养。2.发酵培养基的制备：参见实验器材中的柠檬酸发酵培养基及其制作方法。

二、具体步骤

1．菌种活化与种子的制备菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种黑曲霉，移至斜面培养基，经25~28℃斜面培养至孢子长好，作为活化后的种子（由实验员准备）。发酵用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养基，得到的培养物作为发酵用的种子。2．接种与发酵

取柠檬酸发酵培养基（液）3瓶，用接种环向每瓶接入黑曲霉孢子2~3环，26~28℃摇床培养5~7d，摇床转速120~150rpm，另1瓶不接种留作对照。注意：观察细胞生长情况及变化并记录；观察发酵过程中pH的变化并记录。当pH3左右是积累柠檬酸的最佳时期。。3．发酵液预处理取发酵液经过滤

将3瓶培养液一并过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后弃去。4.发酵产物的检验与分析定性检验（略）：取过滤液和对照液各约5ml，放入试管内，加Deniges液lml，在酒精灯上缓缓加热至沸。逐滴加入20g／LKMn04溶液，若有柠檬酸存在，则出现白色沉淀。纸层析法：展开剂：正丁醇：甲酸：水=40：55：5（V/V/V）；显色剂：0.25g的甲基红和0.25g的溴酚蓝溶于100mL70%的乙醇中，再用0.1mol/L的NaOH调成蓝绿色。层析纸：新华