微生物法转化异丁香酚生成香草醛的研究

微生物法转化异丁香酚生成香草醛的研究研究生：赵丽青导师：孙志浩2005.10.28研究报告ZhaoLi-Qing,SunZhi-Hao,ZhengPu,ZhuLei-Lei.Biotransformationofisoeugenoltovanillinbyanovelstrain,Bacillusfusiformis.BiotechnologyLetters.2005,27:1505~1509

香草醛别名：香兰素、香草素、香兰醛，香茅醛，3-甲基原儿茶醛最重要的香味物质之一，广泛应用于食品、饮料、香料、医药等各领域

市场来源：天然香草醛合成香草醛

合成香草醛丁香精半合成法松柏苷水解法丁香酚法黄樟素法愈创木酚法对羟基苯甲醛法木质素法对甲酚法邻苯二酚法电解合成法最常见：愈创木酚法木质素法年产：＞10000t市场价格

US$11kg-1

天然香草醛香荚兰豆提取法主要生产地：马达加斯加、科摩洛岛、塔希提岛、墨西哥、印度尼西亚、留尼旺、塞古尔、毛里求斯我国：云南、海南年产：20t；约US$3000kg-1

植物细胞培养法未见商业化生产报道

生物转化法生物香兰素指利用真菌、细菌、植物细胞、酶或基因工程菌生物转化木质素、丁子香酚、异丁子香酚等天然化合物前体物，生物合成的香草醛随着消费者对健康的关注及美国和欧盟的规定，天然香兰素的市场需求日益增长生物香兰素是最佳的天然提取香兰素的替代品其在生产规模上一旦形成优势可取代人工合成的香草醛生物技术法前体物质：木质素、丁香酚、异丁香酚、香草醇、香草胺、松柏醇、阿魏酸、芳香族氨基酸等阿魏酸两步法（商业化，US$600kg-1

）主要问题：底物价格较高，生成产物过程复杂，副产物较多

丁香酚/异丁香酚法异丁香酚

丁香酚酶转化法1990年，Yoshimoto等人，分离出一种苯乙烯双氧酶，并从相应的苯乙烯和异丁香酚转化生成香草醛1993年，Markus提出用脂氧合酶以异丁香酚和丁香酚为底物酶法制备香草醛1994年，Mane和Zucca用脂氧化合酶从丁香酚、异丁香酚或松柏醇制备香草醛并得到最高浓度达22.8gl-1的香草醛酶转化法主要问题易受季节及大豆来源、批次等的影响，生产及研究不够稳定

微生物转化法

香草醛浓度普遍偏低FurthertransferredReasonsProductinhibitionSubstrateinhibitionVanillinVanillicacid微生物菌株的筛选各菌株转化异丁香酚生成香草醛能力

反应液（g/L）异丁香酚20K2HPO43H2O14

KH2PO45.2pH7.0，28℃，180r/min，3d

HPLC测定各菌株降解香草醛能力

反应液（g/L）香草醛2K2HPO43H2O14KH2PO45.2pH7.0，28℃，180r/min，3d

反应液总组分GC-MS图谱RT/minCompoundsArea%16.09Isoeugenol11.6016.92Isoeugenol56.9118.83Vanillin13.82SW-B9在异丁香酚存在时的生长情况SW-B9对香草醛的降解情况菌种鉴定生理生化鉴定16SrRNA序列分析形态观察

前期细胞产芽孢细胞成熟芽孢TEM照片1μm1μm

细胞与周身鞭毛

细胞及端生芽孢

16SrRNA序列分析提取细胞总DNAPCR扩增P1(5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’)

P2(5’－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3’)

获得1525个碱基对PCR产物直接测序（宝生物工程（大连）有限公司）该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析

SW-B9及其从GenBank数据库中相关属种构建的系统树

两相转化体系的建立菌株SW-B9在两相体系与单相体系下的转化能力对比主要结论从土壤中筛选获得了性能优异的菌株