POWERPOINT TEMPLATE - 2011全国分子细胞生物学实验技术培训班

临床科研设计与SCI论文策略之二--分子细胞生物学篇湖南省生物医学信息专业委员会赢通基因与细胞工程中心培训部赢润生物技术有限公司培训经理肖伟明PhDWWW.YRBIO.COM2011年6月24日HTTP://YT.HNSCI.NET前节讲座回顾或登陆

查看讲座内容及现场答疑总结2011年6月YRBIO.COM临床研究目的基因筛查2011年6月YRBIO.COM收集临床样本RNADNAProteinmicroRNA芯片基因芯片组织芯片RT-PCR或Real-timePCRWestern-blot免疫组化基因表达差异确定目的基因参考文献microRNA研究本节讨论内容科研选题策略1分子细胞生物学在临床研究中的应用2分子机制的研究方法3论文发表策略42011年6月YRBIO.COM科研选题及设计：以SCI为目的课题新颖/数据量大博览文献、去粕存精它山之玉、可以攻石研究工作者要有思想、善于学习、要有耐心2011年6月YRBIO.COM文献阅读创新性可读性信息量文献内容解决问题创新之处意义所在技术实现文章理念文献内容是否支持作者观点自身研究研究方向最终目标实验技能课题技巧思考消化2011年6月YRBIO.COM研究内容在哪？课题死了么？

1.结论已经发表

2.推理已经证实

3.技术已经应用

4.实验无法实现

5.时间不够用发散思维2011年6月YRBIO.COM研究内容在哪？发现某基因在肝癌组织中表达增高，并有很多机制研究样本差异查文献后，确定在乳腺癌中尚无人涉及，于是，SCI处女作出炉：某基因在乳腺癌组织中表达增高。

已发表内容自身研究内容2011年6月YRBIO.COM我的研究内容在哪？发现辛伐他汀有某种作用，能够治疗某种临床疾病，且对其原理进行了研究，找到了相关基因。

药物处理差异联想到了阿托伐他汀，于是SCI处女作出炉：阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用机制。

已发表内容自身研究内容2011年6月YRBIO.COM我的研究内容在哪？发现某基因具有抗氧化应激的作用机制相似性联想到氧化应激在好多疾病的病理机制中都发挥作用，比如糖尿病肾病、糖尿病神经病变等等，于是SCI处女作出炉：某基因在糖尿病肾病中的作用。

已发表内容自身研究内容2011年6月YRBIO.COM研究内容在哪？发现A基因具有某种作用信号通路联想到A基因的上游或下游基因是B基因，是否也有这种作用？于是SCI处女作出炉：B基因具有某种作用。

已发表内容自身研究内容2011年6月YRBIO.COM研究内容在哪？发现某种药物能够对TNF-α产生影响家族基因拜读大作后，联想到IL-6以及CRP都是炎症因子，有可能这种药物对IL-6以及CRP也有影响，于是SCI处女作出炉：某种药物对IL-6以及CRP的影响。

已发表内容自身研究内容2011年6月YRBIO.COM设计成单一主线，推理严谨。阅读了大量的信息后提出最想解决一个问题。尽量使用常见的技术、机制课题设计：简单清楚易懂2011年6月YRBIO.COM文献阅读-工具（Endnote）或者网站：/pubmed/

数据库问Google、别问百度2011年6月YRBIO.COM案例2011年6月YRBIO.COM4xFigureFormula2011年6月1234YRBIO.COM6xFigureFormula2011年6月1234YRBIO.COM6xFigureFormula2011年6月56YRBIO.COM技术路线基因功能研究目的基因表达调控细胞水平动物水平活性周期运动分化衰老凋亡……….模式动物药物处理临床样本收集组织水平动物组织稳定细胞系药物处理成瘤实验……….免疫组化qPCRWB……….2011年6月YRBIO.COMPlanningFigures：4xFigureStyle分子准备工作、前期初步实验结果引入细胞/组织水平现象作用机制切入作用机制深入可选：模式细胞/动物验证旁通机制临床样本验证模式图Diagram2011年6月123456qPCRWBWBWBRNAiIFFCMIHCDrugsYRBIO.COMMorphology筛选临床研究新基因的方法2011年6月YRBIO.COM所见即所得—分子细胞生物学应用增殖运动凋亡分化衰老自吞噬分泌粘连侵蚀饥饿目的向导型：以现有的样本，为了一个研究目的而实行多种实验观察方案2011年6月YRBIO.COM理清思路gaattcATGACTGCTCAGTCCCGCTCTCCTACCACACCGGTGAACAGCAGCGTGTCCGCCGGCAGCGAACCGAGACCAGCGAG=@#%*@#%*%￥！@*￥！……………2011年6月YRBIO.COM第一手资料：细胞来源2011年6月临床组织样本1原代培养细胞2模式动物组织3实验室常用细胞系4YRBIO.COM如何筛选研究对象2011年6月独特性1通用性2初步研究的提示3便于操作4YRBIO.COM分子细胞生物学思考点2011年6月细胞凋亡1细胞周期2YRBIO.COM技术实现：条条大路通罗马细胞凋亡检测MTTassayWB检测Cyto.CreleaseWB检测SmacreleaseWB检测CaspasecleavageIP检测BaxtranslocationWB检测BidtranslocationBcl-2phosphorylationPARP/DFFcleavageDNAladderPCR扩增法一、分子生物学方法

三、免疫组织化学方法FCMAnnexinVBindingassayIFCyto.CreleaseMitochondrialFraction荧光TUNEL法2011年6月WBFL二、形态学方法

普通显微镜DAPI/33258/PI染色TrypanBlueexclusionassayFCMsubG1/0population电子显微镜YRBIO.COM分子细胞生物学：细胞凋亡2011年6月YRBIO.COMApoptosis：WBAssays2011年6月YRBIO.COMApoptosis：FluorescenceAssays2011年6月Cyto.CReleaseMitochondrialFragmentationfluorescentTUNELNuclearFragmentationYRBIO.COM分子细胞生物学：细胞周期细胞周期检测流式检测WBDetectorCyclinsWBDetectorKinasesWBDetectorNuclearProteins一、形态学方法

二、分子生物学方法

三、免疫组织化学方法普通显微镜DAPI、PI、H2B细胞核观察F-actin染色克隆形成率BrdU渗入免疫荧光细胞核免疫荧光细胞骨架免疫荧光2011年6月YRBIO.COM初步定性2011年6月与对照的区别1WB、IF、qPCR等再次验证2查找文献支持3学术讨论4YRBIO.COMMakeaStory!分子生物学准备蛋白表达抗体制备

蛋白检测/回复检测WB/磷酸化/qPCRCo-IP及Cross-Link

原核表达及Pull-Down检测

酵母双杂交系统

双向电泳细胞学检测活动细胞动态监测免疫荧光细胞组分分析细胞准备及药物处理检测临床样本药物处理基因调控检测DualLuciferaseChIP/EMSAWB/qPCR/IHC检测临床样本RNAiOverexpression动物实验细胞系构建2011年6月YRBIO.COM机制研究切入点凋亡调控StarvationInhibitors>29compoundsInducers>53compoundsanti-Fasreceptorantibody一、蛋白表达调控二、药物处理

高表达AIF、XIAP、FADRNAi

KODominantNegativemutationProteinDepletion2011年6月重复验证YRBIO.COMApoptosis：Inhibitors/life-science/cell-biology/cell-biology-products.html?TablePage=95598392011年6月YRBIO.COMApoptosis：Inducers/life-science/cell-biology/cell-biology-products.html?TablePage=95603232011年6月YRBIO.COM有计划有目的的批量检测细胞凋亡检测MTTassayWB检测Cyto.CreleaseWB检测SmacreleaseWB检测CaspasecleavageIP检测BaxtranslocationWB检测BidtranslocationBcl-2phosphorylationPARP/DFFcleavageDNAladderPCR扩增法一、分子生物学方法

三、免疫组织化学方法FCMAnnexinVBindingassayIFCyto.CreleaseMitochondrialFraction荧光TUNEL法2011年6月二、形态学方法

普通显微镜DAPI/33258/PI染色TrypanBlueexclusionassayFCMsubG1/0population电子显微镜YRBIO.COM细胞周期调控细胞周期调控DNA复制阻断thymidineDNA修复阻断蛋白合成的阻断一、细胞骨架处理

二、细胞复制阻断

三、药物处理F-actin

打断Tubulin处理BrdU渗入免疫荧光细胞核免疫荧光细胞骨架免疫荧光2011年6月YRBIO.COM分子生物准备？分子生物学准备蛋白表达抗体制备

蛋白检测/回复检测WB/磷酸化/qPCRCo-IP及Cross-Link

原核表达及Pull-Down检测

酵母双杂交系统

双向电泳细胞学检测活动细胞动态监测免疫荧光细胞组分分析细胞准备及药物处理检测临床样本药物处理基因调控检测DualLuciferaseChIP/EMSAWB/qPCR/IHC检测临床样本RNAiOverexpression动物实验细胞系构建2011年6月YRBIO.COM外包繁琐的分子准备工作基因调取/序列比对生物信息学操作载体构建/基因突变病毒包装RNAi干扰构建蛋白表达引物/探针细胞株建立赢润生物提供全面的分子细胞生物学服务（）如果我的博士生一年构建不到200个Constructs，那他是没法做科研！中科院PI陈大华2011年6月YRBIO.COM科研准备建立稳定的实验平台1根据课题设计技术路线3循序渐进:基因、蛋白、细胞2依课题需要改进技术42011年6月技术向导型：基于成熟实验方案设计严谨的课题YRBIO.COM自成体系的实验方案2011年6月相互佐证1主线明朗2循序渐进3YRBIO.COM应用成熟实验技术：qPCR1建立qPCR平台：仪器选型试剂选购RT-PCR标准仪器维护2SOP编写统一实验流程MIQEmRNA提取统一试剂上机操作流程数据分析3技术深入：SYBRGeneCopynumberTaqman™MutationTaqman™ArraySNPGenotypingmiRprofilingDigitalqPCRTaqman™qPCR

Bloting2011年6月YRBIO.COM应用成熟实验技术：WesternBlot1搭建稳定的实验平台2SOP：标准实验流程设立严密的对照设立多种分组方式统一实验批次三次平行实验验证暴光时间设定图像分析/量化3技术深入：

WBIPCoIPCrossLinkChIPEMSA蛋白制备/温度控制蛋白定量SDS转印控制WB+显影方式2011年6月YRBIO.COM应用成熟实验技术：免疫荧光1建立临床应用平台:细胞培养/切片处理染色方案成像系统2SOP：标准实验流程设立严密的对照设立多种分组方式平行实验佐证试剂浓度定制成像暴光时间控制图像编辑与数据分析定性/定量分析3技术深入：ImmunoStainingIFDoubleStainingTripleStainingTimeLapseFluoresceFLAPFRETFISH2011年6月YRBIO.COMMakeaStory!分子生物学准备蛋白表达抗体制备

蛋白检测/回复检测WB/磷酸化/qPCRCo-IP及Cross-Link

原核表达及Pull-Down检测

酵母双杂交系统

双向电泳细胞学检测活动细胞动态监测免疫荧光细胞组分分析细胞准备及药物处理检测临床样本药物处理基因调控检测DualLuciferaseChIP/EMSAWB/qPCR/IHC检测临床样本RNAiOverexpression动物实验细胞系构建2011年6月YRBIO.COM