bDNA,NASBA,LAMP技术原理与应用

bDNA,NASBA,LAMP技术原理与应用核酸检测技术变温检测技术PCR(polymerasechainreaction)

LCR(ligaseamplificationreaction)Real-timePCR等温检测技术核酸等温检测技术信号的放大bDNA(branchedDNA)模板的扩增TAS(Transcription-BasedAmplificationSystems)

３ＳＲ(self-sustainedsequencereplication)ＮＡＳＢＡ(nucleicacidsequence-basedamplification)ＳＤＡ(stranddisplacementamplification)ＬＡＭＰ(loop-mediatedisothermalamplification)bDNA技术原理与应用bDNA的合成bDNA检测应用DetectionofTrypanosomabruceispp.inHumanBloodbyaNonradioactiveBranchedDNA-BasedTechniquebDNA检测技术特征５条探针，其中只有两条目标探针要设计，其它探针都可以模块化。目标检测片段不会进行数量扩增。样本处理十分简单，不需要纯化ＤＮＡ。防止了扩增产物的污染问题。防止了ＰＣＲ抑制因素可能带来的假阴性问题。试剂无需冷藏保存。采用仪器或照相机检测化学发光。可高通量进行检测不同病原体。NASBA技术原理与应用NASBA检测应用NASBA检测技术特征使用反转录酶,RNA酶H,T7RNA聚合酶进行循环反响.上游引物带有Ｔ７RNA聚合酶结合位点，下游引物带有ＥＣＬ检测核苷酸序列，此外，还有一条俘获探针用于固定扩增产物．扩增产物是单链ＲＮＡ，后续操作较复杂．连续等温反响,特殊仪器进行检测,特异性强，灵敏度高．可与分子信标探针联合使用，进行单管实时荧光检测．LAMP技术原理与应用5’3’B3B2B1F1CF2CF3CLAMP引物位置与命名FIP=F1C+TTTT+F2BIP=B1C+TTTT+B2B3F3(LoopF,LoopB)引物Ｔm值的选择F3,B3<F2,B2<F1,B160<F2,B2<65LAMP引物设计原那么引物间的距离F2与B2之间的碱基数约为120-180个,F2与F3或者B2与B3间的碱基数为20个以内,F2与F1或者B2与B1之间碱基数为40~60个，B1与F1之间可以没有碱基间隔。引物的Tm值正常情况下或者富含GC区域为60-65度，富含AT区域为55-60度。引物末端的稳定性F1C与B1C的5’端，F2/B2，F3/B3的3’端6个碱基的dG值要小于-4kal/mol.GC含量与二级结构GC含量约40-60%。尽量防止二级结构的产生，尤其是3’端。其它事项在目标区域引物以外的序列中存在的限制性内切酶位点，可以用来确认扩增产物。常用反响体系FIP,BIP:40pmolF3,B3:5pmolloopF,B:20pmoldNTPBetaineTween20:0.1%(NH4)2SO4:10mMMgSO4:8mMKcL:10mMTris-Hcl(pH8.8):20mMBst:8ULoop引物的引入有助于提高灵敏度，缩短反响时间LAMP扩增产物电泳分析Ladder-likepatterningel-electrophoresisLAMP结果分析肉眼观察显白色沉淀DNA与SYBRGreen结合现示绿色Bst聚合酶于30分钟到一个小时内可将毫微微克/毫升(fg/ml)〔或500-100拷贝/毫升〕的DNA或RNA扩增到10微克左右。LAMP结果分析仪器特点：检测专用，每隔6秒测定反响产物的浊度．2.可以设定相应的反响条件与检测要求．3.测定结果可直接输入电脑进行实时分析．4.检测结果〔图像等〕可以打印．5.可同时检测32个样本，８联管适用．LAMP检测法特征检测是连续等温进行的。扩增效率十分高，反响灵敏。采