新冠肺炎实验室建立文件系列之2 新型冠状病毒核酸检测标准操作程序

新冠肺炎实验室建立文件系列之2新型冠状病毒核酸检测标准操作程序新冠肺炎实验室建立文件系列之2新型冠状病毒核酸检测标准操作程序110次修订2020年**月**日实施02新型冠状病毒核酸检测标准操作程序目的规范PCR方法检测新型冠状病毒核酸的工作程序，保证实验结果的正确可靠。范围适合于检验科发热门诊。职责检验人员负责按照本检测细则对被检样本进行检测；复核人员负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核；专业组负责人负责对专业组综合管理和检测报告的审核。程序、内容和要求任何新型冠状病毒的检测都必须在具备适当条件的实验室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。本程序中的核酸检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框openreadingframe1a）和核壳蛋白nucleocapsidprotei。在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件：同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性PCR检测结果均为阳性。PCR抑制等。样本采集（/咽拭子）咽拭子（使用透景样本保存液）用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入样本保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖作为样本使用。鼻拭子（使用透景样本保存液）将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔鼻咽拭子样本（未使用透景的保存液：在有鼻咽拭子的收集管中加入1ml生理盐水，振荡混匀后将全部液体倒入1.5ml灭菌离心管中作为样本使用。标本保存用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测24-70℃或以下保存（-70℃冰箱暂存。应设立专库或专柜单独保存标本，标本运送期间应避免反复冻融。样本灭活为了减少感染样本对人和环境的潜在危害，推荐样本检测前进行灭活处理：先56℃干/水浴60，静置10n至室温（避免气溶胶，然后进行处理。核酸提取Smart32核酸提取仪提取程序操作前准备96孔提取板内。运行实验程序前，检查96孔提取板及磁棒套是否正确放置（磁棒套顺着卡槽推入到尽头。操作确保仪器的电源线与合规格的电源插座连接好后，打开仪器背面右下的主电源开关。仪器上电开机后，进行自检。如下图所示：待完成自检后系统进入主菜单操作界面。如下图所示：主界面主要包括仪器功能选项及快捷实验运行方式的图标及“程序列表e) 点击和e) 点击和按键查看完整程序运行步骤；f)点击按键后，实验程序将开始运行。注意：96注意：磁棒套是否推入到位；注意：仪器门是否关好。能打开。实验结束后，仪器弹窗实验结束。k) 点击k) 点击进行紫外灯照射消毒。Smart32核酸提取仪日常维护Smart32器不需要定期的维护，但是，应由经过厂商指导的实验室技术人员进行定期的清洁与自测诊断。Smart3210%的家用漂白剂及去离子洗或执行任何本节所提到的维护前，务必关闭Smart32仪器及相关设备的电源；清洁仪器时请小心，确保无液体流入仪器中。核酸提取或纯化试剂标准操作程序原理、磁珠洗涤液2用下，将蛋白质，无机盐离子和许多有机杂质去除。然后洗脱液将纯净的核酸洗脱下来。标本要求标本类型：血清、血浆、宫颈脱落细胞、咽拭子、鼻咽分泌物等。标本采集：血清/血浆—用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25ºC）放置30～60分钟，血标本可自发完全凝集析出血清，1500rpm离心51.5ml血浆—用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静1.5ml灭菌离心管。方案。宫颈脱落细胞标本的采集需医护人员先用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用宫颈刷置于宫颈口，瞬时针旋转4-6周以获取足量的上皮细胞，然后取宫颈刷置于盛有2ML生理盐水的无菌小试管中。2～8℃12-20150℃12小时送达。标本拒收状态：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。试剂及仪器设备试剂名称：核酸提取或纯化试剂。ft大学达安基因股份有限公司人份/盒962块，蛋白酶K1瓶。贮存条件和有效期：室温保存；有效期12个月。Smart32核酸提取仪。操作试剂准备（在试剂准备区操作，从试剂盒中取出预分装96孔深孔板，颠倒混匀数次96500rpm1小心撕去封膜，防止液体溅出。标本制备及加样（在标本制备区操作。HCVHCV临界阳性质控品进96、7列（A-H排）200ul20ul蛋白酶。使用smart32型核酸提取仪进行核酸提取（操作见smart32核酸提取仪标准操作程序）程序设置（smart32型核酸提取仪程序编辑）步 孔 等待时混合时吸磁次 混合速容积名称 温度状态 温度℃骤 位 间min 间min 数 度 ul12磁珠013中400关021磁珠结合液0153快750第一孔7033磁珠洗涤液1022快600第6孔5044磁珠洗涤液2001中600第6孔7056洗脱液053中100第6孔7063丢弃磁珠010中600关0612-20℃。注意事项实验前请仔细阅读本试剂说明书。不同型号的核酸提取仪由于硬件的关系可能需设置不同的提取程序试剂厂家。标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃。10%75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。物生物医学实验室生物安全通用准则和医疗废物管理条例样本释放剂标准操作程序预期用途样本的采集保存、病毒灭活裂解、核酸的释放。采集拭子样本，放入含有样本核酸释放保DNA或RNAPCR原理的核酸保护剂成分，对DNA或RNA适用范围：拭子类样本（/鼻/眼结膜）使用方法4℃7-20℃或-80℃。56℃灭活30分钟。15“/至少操作3PCR体系进行扩增。释放出的核酸可在室温放置48h，4℃存放1个月，-20℃或-80℃存放6个月。性能指标4℃7-80℃可长期保存。PCR检测，对PCR反应无明显抑制作用。注意事项本产品仅用于体外检测，实验前请仔细阅读本说明书。的试管、吸头需打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；样本操作和实验室管理应严格按照PCR实验过程严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；DNA/RNA酶的PCR反应管和吸头。新型冠状病毒（2019-nCoV）基因扩增检测RT-PCR2019（2019-nCoV）ORF1ab和N（N基因探针采用FAM标记，ORF1ab探针采用Yellow标记）用于标本中2019新型冠状病毒RNA的检测。荧光定量扩增仪。操作新冠肺炎实验室建立文件系列之2新型冠状病毒核酸检测标准操作程序新冠肺炎实验室建立文件系列之2新型冠状病毒核酸检测标准操作程序110次修订2020年**月**日实施试剂准备（在试剂准备区操作），从试剂盒中取出NC(ORF1ab/N)PCR反应液A、NC(ORF1ab/N)PCR反应液离心数秒后使用。取N（N＝+NC(ORF1ab/N)+NC(ORF1ab/N)阳性质控品反应管，单人份扩增体系配制如下表：标本制备及加样（在标本制备区操作标本处理：使用样本释放剂采样管直接采样送检：将采样后的拭子高出采样管的部分折断，拭子头浸没在含有400uL管中，拧紧管盖送检；将采样管置于56℃303015分钟使核酸释放。使用核酸提取仪：取200ul液体样本加入磁珠提取试剂样本孔位，使用smart32型核酸提取仪进行核酸提取（smart32核酸提取仪及核酸或纯化试剂标准操作程序）单管单人份PCR5ul，6000rpm1分钟。记录标本处理情况。扩增（在扩增区操作）PCR1515分钟，1个循环；94℃15秒55℃45秒)，45个循环。结果判定（ABI7500全自动分析仪器）反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold（3～15End5～20，LogThresholdValue值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线，点击s窗口读取检测结果。记录检测结果，签发检测结果报告。结果判断如果检测样品在FAM和VIC通道无扩增曲线或CtCy5通道有扩增曲2019(2019-nCoV)RNA；新冠肺炎实验室建立文件系列之2新型冠状病毒核酸检测标准操作程序新冠肺炎实验室建立文件系列之2新型冠状病毒核酸检测标准操作程序110次修订2020年**月**日实施如果检测样品在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明显的扩增曲线，可判样品为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)阳性；如果检测样品仅在FAM或VIC单一通道Ct值2019新型冠状病毒(2019-nCoV)2019(2019-nCoV)RNA。质量控制NC(ORF1ab/N)VIC通道有明显扩增曲线；M和Ct值，Cy5需重新进行。性能指标及线性范围500copies/ml2019新型冠状病毒种属相近或引起症状相似的其（如季节性甲型H1N1H1N1(2009)流感病毒H3N2，，乙型流感，乙型流感，呼吸道合抱病毒A型，呼吸道合抱BIIIIII、、345、755型，肠道病毒ABCD型，人间质肺病毒（人偏肺病毒B病毒，麻疹病毒，人巨细胞炎克雷伯杆菌，结核分枝杆菌，烟曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隐球菌，冠状病229SS冠状病毒以及人基因组无交叉反应。注意事项本产品仅用于体外检测，实验前请仔细阅读说明书；处理均需符合相关法规要求和《医疗废物管理条例产物处理：PCRRNA紫外光杀菌的化学通风橱或生物安全柜完成操作，避免有害物质进入呼吸道；5.使用经高压灭菌的一次性离心管和吸头或购买无DNARNA酶的离心管和吸头；PCR7如果在样本处理中没有控制好交叉污染，可能出现假阳性；实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范（本制备区、扩增检测区，所用消耗品应灭菌实验完毕用10%次氯酸或75%20-30分钟；-20℃待用(24h内)；11.须对每次实验进行质量控制。样本处理及检测过程操作不规范等，请严格按照说明书操作。因拭子等样本采集过程应结合临