重组人血小板生成素的研究与开发（0502终稿）

重组人血小板生成素（rhTPO）的研究与开发指导教师：胡昌华教授辅助指导：赵燕莉学姐搜集整理资料：孙振鹏赵丽丽翻译文献、校稿：赵娜薇李娅男PPT动画制作：赵振国关于血小板概述大量存在于血液中无核盘状小细胞〔直径约3μm〕。

其生成受血液中的血小板生成素(TPO)调节。成年人血液中血小板数量为10～30万/mm3。作用功能促进止血;加速凝血;维护毛细血管壁完整性。血小板减少的原因及病症血小板生成减少：

①遗传性

②获得性血小板破坏增加：

①非免疫性

②免疫性其他：脾亢、出血等。反复化疗更容易导致血小板减少传统治疗方法——血小板输注存在的弊端主要有：1〕同种异体免疫反响：导致无效性血小板输注；2〕输血感染；3〕过敏反响；4〕来源困难，价格昂贵等。

因此，新型治疗血小板减少症的特效药物的研发具有较为可观的经济价值和深远的社会影响……主要内容关于TPO和rhTPO研究历史和现状主要生产方法及技术参与竞争的主要公司目前存在问题及改进前景与展望关于TPO与rhTPO重组人血小板生成素〔rhTPO〕是采用现代基因工程技术，以原核或真核细胞为宿主进行分泌表达的全长糖基化基因工程蛋白类物质，具有与内源性TPO相似的特异性升高血小板数的药理作用。巨核细胞TPO血小板生成素〔内源性细胞因子〕与受体结合刺激增殖分化成熟血小板TPO①主要在肝脏合成；②332个Aa、95kD的糖蛋白；③两个结构域：受体结合结构域；富糖结构域。TPO受体〔c-Mpl〕

①含有2个细胞因子受体同源结构。

②TPO与末端CRM结合、激活c-Mpl、启动细胞内信号转导研究历史和现状1958年，Kelemen等人发现在血小板减少症病人血浆中，存在一种可促进巨核细胞成熟及血小板生成的物质并命名为血小板生成素(TPO)。1994年，科学家采用反相及常规生物技术，从多个样本中纯化得TPO。第1代TPO分子包括rhTPO、聚乙二醇化重组人巨核细胞生长衍生因子(PEG-rHuMGDF)。但由于临床试验中不良反响的存在,第1代TPO分子在英美等兴旺国家已停止了研究，在国内得到一定程度的开展。进入21世纪以来，第2代TPO以其可口服给药，且相比第一代在免疫原性方面有所改善等优点被广泛研究。主要包括3类:TPO肽类模拟物、TPO非肽类模拟物和TPO冲动剂抗体。它们以不同方式结合并冲动TPO受体从而发挥生物学效应，局部正进行临床试验。主要方法和技术路线

1大肠杆菌表达系统2酵母细胞表达系统

3CHO表达系统

(一)大肠杆菌表达系统

概述通过构建GST-TPO融合蛋白表达质粒，在tac启动子作用下实现了在TPO在原核细胞中的高效表达，再经GST亲和色谱及凝血酶酶切得到TPO目的产物。评价具有刺激巨核细胞和血小板生成的生物活性；表达水平较低；产物别离纯化技术尚未成熟。〔二〕酵母细胞表达系统

概述以人胎肝cDNA文库为模板，通过PCR引物设计、扩增使毕赤酵母信号肽序列取代TPO固有序列,经电转化筛获重组酵母,并用甲醇进行诱导表达。评价目的蛋白产量有待于提高；产物的别离纯化工艺尚不成熟；表达产物生物学活性不稳定等。〔三〕CHO表达系统概述将含有编码人血小板生成素核苷酸序列的CHO细胞接种在细胞罐内扩增培养得到高表达收获液。然后通过一系列纯化工艺，获得高纯度和生物活性的rhTPO。评价适于rhTPO的大规模生产；终产物纯度较高；别离纯化表达产物的步骤过于繁琐。方法与技术路线〔上游阶段〕rhTPO转化细胞的筛选目的基因的扩增转染细胞目的基因的检测目的基因的获得组建重组质粒构建工程细胞质量控制配制药品制剂目的产物的分离纯化培养工程细胞株AddYourTextAddYourTextAddYourTextAddYourText方法与技术路线〔下游阶段〕GO目的基因的获得〔PCR〕1.模板变性双链DNA模板在95C变性为单链DNA。2.引物退火引物与单链DNA互补并退火。3.延伸反响耐热的DNA聚合酶催化子链的合成。Back组建重组质粒B质粒A质粒pDC-T质粒王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001Back构建工程细胞用磷酸钙介导的转染法进行转染Back磷酸钙介导的转染法Back转化细胞的筛选王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001Back目的基因的扩增王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001Back转染细胞目的基因的检测王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001Back培养工程细胞株细胞增殖rhTPO的表达StepⅠStepⅡBack目的产物的别离纯化经过SDS、HPLC检测证明，种产品纯度。浓缩脱盐阴离子交换层析疏水层析凝胶过滤层析Back配制药品制剂Back质量控制Back沈阳三生制药股份历经近10年的潜心研发得出的药物“特比澳〞〔入选至国家“863〞方案、“十五〞重大科技工程〕曾于2005年5月获得国家一类新药证书，成为世界上第一个完成rhTPO临床试验并被批准上市的基因工程药物。rhTPO商品化药物的出现参与竞争的主要公司〔包括试验阶段的同类产品〕国内上市的治疗血小板减少症的药物〔包括非TPO类〕产品名称

生产商

规格

特比澳（rhTPO）沈阳三生制药股份有限公司15000u/ml3000u/ml7500u/ml等

吉巨芬（rhIL-11）浙江杭州九源基因工程有限公司、齐鲁制药有限公司3mg（2.4×107AU）/支

氨肽素丹东华盛生物制药有限公司每片0.2g复方皂矾丸陕西郝其军制药有限责任公司每丸0.2g醋酸泼尼松片山东新华制药股份有限公司每片5mg地塞米松天津天药药业股份有限公司每片0.75mg硫唑嘌呤片浙江奥托康制药集团股份有限公司每片50mg静脉注射用人免疫球蛋白武汉瑞德生物制品有限责任公司、北京天坛生物制品股份有限公司有效成分IGg含量为50g/L特比澳〔rhTPO〕与吉巨芬〔IL-11〕两种药物的细化比照特比澳耐受性试验单次给药参考文献中国医学科学院学报200426〔4〕:437-41减少血小板数恢复所需天数目前存在的问题及改进已实现商品化的药物〔特比澳〕存在的问题偶有发热、肌肉酸痛等；生产工艺复杂；终产物价格昂贵，多数阶层患者难以承受。仍处于实验室阶段的研究成果存在的问题第1代TPO相关分子聚乙二醇化重组人巨核细胞生长衍生因子，具有免疫原性，故而终止试验。优化改进

别离提取工艺方面；生物活性的保证；适当降低所需本钱；最优化治疗剂量、疗程的探讨。前景与展望葛兰素史克公司正在研发的产品第二代TPO分子Promacta，是口服非肽类血小板生成素受体冲动剂，临床前和前两期临床研究显示本品可升高血小板数目。其他第2代TPO分子尚处于临床前试验阶段〔如：美国安进公司A