小麦Rubisco单克隆抗体的制备oweroin文档

学生:袁秋华导师:顾蕴洁教授王忠教授小麦Rubisco单克隆抗体的制备Rubisco首先由Wildman和Bonner于1947年从菠菜叶中作为一种可溶性大分子蛋白质被发现，当时称为“分部I蛋白（fractionIprotein”）。后来碳同化研究发现分部I蛋白就是催化光合作用中co2固定的RuBp羧化酶。1971年发现RuBp羧化酶是一个双功能酶，它还能催化RuBp的氧化作用。此后该酶就被称为核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶，简称Rubisco。Rubisco的发现

Rubisco的结构

所有真核和大多数原核的光合有机体中的Rubisco由8个大亚基和8个小亚基组成，大亚基一般由475个氨基酸残基组成，不同来源的Rubisco大亚基序列有80%以上的同源性，而且特别是在169—220和321—340之间的氨基酸残基序列，在不同有机体中几乎完全一致，现在已知这些区域含有与催化及活化过程有关的氨基酸残基。大多数Rubisco小亚基由123个氨基酸残基组成，不同植物间小亚基氨基酸序列的同源性比大亚基低得多，一般在70%左右，然而，小亚基序列中有两个区域非常保守，即残基10—21和61—67，暗示这些部分可能有什么重要功能。Rubisco的结构图

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（简称Rubisco）催化卡尔文循环中最初的CO2固定，使核酮糖-1，5-二磷酸（RuBp）与CO2形成两分子3-磷酸甘油酸。该酶也同时催化光呼吸作用中的第一个步骤，使RuBp与O2反应产生一分子磷酸甘油酸和一分子磷酸乙醇酸。因此Rubisco处于光合碳还原和光合碳氧化两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，它对净光合速率起着决定性的影响。

Rubisco的功能Rubisco的纯化Rubisco的纯度鉴定利用ND和SDS鉴定Rubisco纯度。Rubisco的纯度鉴定结果Rubisco的非解离聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Rubisco的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果97.466.2453120.114.4大亚基小亚基Rubisco标准蛋白

分子量（×1000）我们得到高纯度的Rubisco后，就可以制备其单克隆抗体了，下面先跟大家介绍一下单克隆抗体制备的技术。抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonalantibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。单克隆抗体产生的背景1975年，，Kohler和Milstein大胆地把丧失失合成次黄嘌嘌呤-鸟嘌呤磷酸核核糖转移酶（（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞胞与经绵羊红红细胞免疫的的小鼠脾细胞胞进行融合。。融合由仙台台病毒介导，，杂交细胞通通过在含有次次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选选择。在融合合后的细胞群群体里，尽管管未融合的正常常脾细胞和相互融合的脾脾细胞是HGPRT+，但不能连续培培养，只能在在培养基中存存活几天，而而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活活，只有骨髓瘤细胞与与脾细胞形成成的杂交瘤细细胞因得到分别来来自亲本脾细细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤瘤细胞的连续续继代特性，，而在HAT培养基中存活活下来。实验验的结果完全全像起始设计计的那样，最最终得到了很很多分泌抗绵绵羊红细胞抗抗体的克隆化化杂交瘤细胞胞系。用这些细胞系系注射小鼠后后能形成肿瘤瘤，即所谓杂杂交瘤。生长长杂交瘤的小小鼠血清和腹腹水中含有大大量同质的抗抗体，即单克克隆抗体。单抗制备的原原理单克隆抗体概概念1975年，，Kohler和Milstein建立了淋巴细细胞杂交瘤技技术，他们把把用预定抗原原免疫的小鼠鼠脾细胞与能能在体外培养养中无限制生生长的骨髓瘤瘤细胞融合，，形成B细胞杂交瘤。。这种杂交瘤瘤细胞具有双双亲细胞的特特征，既像骨骨髓瘤细胞一一样在体外培培养中能无限限地快速增殖殖且永生不死死，又能像脾脾淋巴细胞那那样合成和分分泌特异性抗抗体。通过克克隆化可得到到来自单个杂杂交瘤细胞地地单克隆系，，即杂交瘤细细胞系，它所所产生的抗体体是针对同一一抗原决定簇簇的高度同质质的抗体，即即所谓单克隆抗体（monoclonalantibody），，简称单抗。单抗与多抗的的比较优点缺点单抗针对单一抗原纯度高专一性强重复性好能持续地无限量体外繁殖获得高效价的单抗往往需要耗费较多的人力物力与时间，因此其价格也较高

,适应性窄

多抗识别的适应性宽，制备价格相对较低

针对多个抗原纯度不高专一性不强重复性较好每次都要从动物血清中提取杂交瘤细胞的的筛选方法：1、免疫酶技术2、免疫荧光技术术3、间接血凝试验验4、放射免疫测定定免疫酶技术是是将抗原抗体体反应的特异异性和酶对底底物显色反应应的高效催化化作用有机结结合而成的免免疫学技术。。由于它特异异性高，灵敏敏度高，现已已广泛用于筛筛选和鉴定单单抗。间接血凝试验验又称被动血血凝试验（PHA），是目前应用较较广的检测方方法之一。本本试验是以包包被可溶性抗抗原的红细胞胞作为指示系系统，当被检检抗体与包被被在红细胞上上的抗原产生生特异性反应应时，导致红红细胞凝集现现象。可见，，该法具有灵灵敏、快速、、容易操作和和无需昂贵仪仪器等优点，，而且经改用用醛化红细胞胞以后，克服服原来重复性性差的缺点。。放射免疫测定定是用放射性性同位素标记记抗原或抗体体，以检测相相应抗原或抗抗体的定量方方法。在筛选选和鉴定单抗抗时常用抗原原固相法，即即用抗原包被被聚乙烯微板板，借以检测测样品中的McAb包被洗涤封闭洗涤加一抗用碳酸盐Buffer将两酶抗原稀稀释到所需浓浓度，每孔加加入100μL，4℃包被过夜。每孔加入保温温液200μL，37℃℃孵育3h（或4℃过夜））。每孔加入经稀稀释液稀释的的待测抗血清清样品100μL，同时设立阴性性对照，37℃孵育2h。单抗检测（间接ELISA））用PBST洗涤3次，每每次洗浸泡5分钟后拍干干。结果判定洗涤涤终止止显色色洗涤涤加二抗每孔加入稀释释至工作浓度度的羊抗鼠IgG二抗100μL，37℃℃孵育2h。每孔加入OPD底物溶液100μL，37℃℃避光反应15min左右。在490nm波长下测定样样品的OD值，结果以P／N比值表示，即即将样品的OD值与阴性样品品OD值的均值相比比，若大于1.5倍，即即判为阳性。。用2mol/L的硫酸溶液终终止。杂交瘤细胞的的克隆化a、制备小鼠腹腔腔细胞。同““细胞融合””一节中的方方法。b、制备待克隆的的杂交瘤细胞胞悬液，用含含20%血清清的HT培养基稀释至至每毫升含2.5、15和50个细细胞3中不同同的稀释度。。c、按每毫升加入入5×104-1×105细胞的比比例，在上述述杂交瘤细胞胞悬液中分别别加入腹腔巨巨噬细胞。d、每种杂交瘤细细胞分装96孔板一块，，每个稀释度度32孔，每每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤瘤细胞数分别别为0.5、、3和10。。e、37℃、、7.5%CO2湿润培养7-10天，出出现肉眼可见见的克隆即可可检测抗体；；在倒置显微微镜下观察，，标出只有单单个克隆生长长的孔，取上上清作抗体检检测。f、取抗体检测阳阳性孔的细胞胞扩大培养，，并冻存。（1）有限稀释法法（2）软琼脂法a、在培养皿中制制备饲养细胞胞（小鼠腹腔腔细胞）单层层。b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐盐水溶液与等等量双倍浓度度的HT培养基混匀，，配成1%琼脂糖培养液液，45℃水浴中温育育。c、吸去平皿上层层培养液，加加入1%琼脂糖培养液液3ml，室温10分钟。d、取杂交瘤细胞胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液液1ml混匀，铺于上上层