植物组织培养技术-知识分享

第一页，共49页。专题(zhuāntí)3植物(zhíwù)组织培养技术第二页，共49页。思考(sīkǎo)1、原理(yuánlǐ):2、必要条件(bìyàotiáojiàn)：植物细胞的全能性细胞离体一定的营养物质、激素和其他外界条件外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官植物组织培养技术第三页，共49页。3、细胞(xìbāo)的全能性①定义(dìngyì)：生物体的细胞具有(jùyǒu)使后代细胞形成完整个体的潜能的特性②原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因已分化的植物细胞，仍具有全能性③实例受精卵>生殖细胞>体细胞④全能性的比较:第四页，共49页。1）、培育无病毒(bìngdú)植株2）、培养紫草愈伤组织(zǔzhī),提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4)、基因工程中亦需到植物(zhíwù)组织培养的方法4、植物组织培养的应用：3）、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题第五页，共49页。课题目标说明植物组织培养的基本原理，学习植物组织培养的基本技术，进行菊花或其他植物的组织培养。课题重点与难点(nádiǎn)课题重点：植物组织培养过程中使用的无菌技术。课题难点(nádiǎn)：植物组织培养过程中使用的无菌技术。课题1：菊花的组织培养第六页，共49页。一、基础知识1、植物(zhíwù)的组织培养（1）细胞(xìbāo)的分化①概念(gàiniàn)：在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程②过程：如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统第七页，共49页。③特点(tèdiǎn)：（2）稳定(wěndìng)性：细胞分化是稳定(wěndìng)的，一般是不可逆转的（3）全能性：已分化的细胞，仍具有(jùyǒu)发育的潜能（1）持久性：是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度⑤原因：基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果④结果：形成不同的细胞和组织第八页，共49页。2、植物(zhíwù)组织培养过程:离体组织(zǔzhī)或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织(zǔzhī)芽根细胞分裂素>生长素细胞分裂素<生长素再分化植物细胞培养第九页，共49页。脱分化：指已经分化的植物器官、组织或细胞,当受到创伤或进行离体(也受到创伤)培养时,已停止(tíngzhǐ)分裂的细胞,又重新恢复分裂,细胞改变原有的分化状态,失去原有结构和功能,成为具有未分化特性的细胞。再分化：已经脱分化的细胞在一定条件下,又可经过愈伤组织或胚状体,再分化出根和芽,形成完整植株(zhízhū),这一过程叫作再分化。愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度(gāodù)液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞第十页，共49页。菠萝(bōluó)的愈伤组织第十一页，共49页。愈伤组织(zǔzhī)第十二页，共49页。2、影响植物(zhíwù)组织培养的因素（1）植物(zhíwù)材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为(jiàowéi)容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养，如芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季第十三页，共49页。（2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊(tèshū)，需配置不同的培养基MS培养基主要(zhǔyào)成分包括：A、大量(dàliàng)元素:N、P、K、Ca、Mg、S等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有机物:如氨基酸、烟酸、肌醇、维生素，蔗糖等D、植物激素第十四页，共49页。①常用(chánɡyònɡ)的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素（3）植物(zhíwù)激素的影响使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞即分裂也分化同时使用分化频率高②生长素和细胞分裂素作用(zuòyòng)第十五页，共49页。生长素细胞分裂素：>有利于根的分化(fēnhuà)生长素细胞分裂素：<有利于芽的分化(fēnhuà)，抑制根的分化(fēnhuà)生长素细胞分裂素：＝促进愈伤组织(zǔzhī)生长③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响（4）pH、温度、光照pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日用日光灯照射12h生长素细胞分裂素：<第十六页，共49页。讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方(pèifāng)相比，MS培养基的配方(pèifāng)有哪些明显的不同？答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径(tújìng)受到一定影响后所产生的特殊营养需求。

微生物培养(péiyǎng)基以有机营养为主。与微生物的培养(péiyǎng)不同，MS培养(péiyǎng)基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。第十七页，共49页。

植物(zhíwù)组织培养过程离体的植物器官(qìguān)、组织、细胞脱分化(fēnhuà)愈伤组织再分化芽根植物体组织培养实验过程简图移栽第十八页，共49页。制备(zhìbèi)MS固体培养基外植体消毒(xiāodú)接种(jiēzhòng)培养栽培二、实验操作移栽第十九页，共49页。MS培养基的配制(pèizhì)操作步骤（1）MS培养基母液的配制:MS培养基含有十几种化合物，配制不方便也难称量准确，可将培养基中的各种成分扩大一定倍数分别(fēnbié)称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。(母液配制见下表)第二十页，共49页。第二十一页，共49页。（2）MS（1000mL）培养基的配制:按比例分别取适量各种(ɡèzhǒnɡ)成分的母液，加入烧杯，称取蔗糖30g，琼脂7g，加水并加热使琼脂溶解，按照需要的浓度分别加入激素，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl溶液调节pH至5.8~6.0。将配好的培养基迅速分装至组培瓶中，拧上盖子，放入灭菌锅121℃，灭菌20min。③培养基的分装(fēnzhuānɡ)注：由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此(yīncǐ)不必添加植物激素3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌第二十二页，共49页。植物(zhíwù)组培具体操作步骤（1）取材：取菊花生长旺盛的嫩枝(外植体不能太小，否则(fǒuzé)会影响愈伤组织的形成)。（2）消毒与修剪外植体：①流水冲洗后,加少许洗衣粉刷洗,流水冲20分钟;②放入70﹪酒精中摇动2~3次,持续6~7秒,无菌水冲洗2~3次，用无菌吸水纸吸干;③放入质量分数为0.1%氯化汞溶液中浸泡1～2分钟,无菌水冲洗2~3次，无菌吸水纸吸干。（3）接种第二十三页，共49页。常用灭菌剂使用浓度及效果(xiàoguǒ)比较表第二十四页，共49页。植物组织培养消毒(xiāodú)与接种示意图第二十五页，共49页。接种(jiēzhòng)注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数(fēnshù)为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照(guāngzhào)条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分第二十六页，共49页。思考：你打算做几组重复(chóngfù)？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明(shuōmíng)培养基制作合格，没有被杂菌污染。第二十七页，共49页。（4）培养(péiyǎng)1、愈伤组织(zǔzhī)的培养从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，见不见光因不同植物而异，菊花在见光条件下愈伤组织长的更快。胡萝卜无光才长得好。2周后，培养基成分(chéngfèn)接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养，约20d2、试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗培养第二十八页，共49页。（五）移栽(yízāi)1、打开(dǎkāi)封口膜2、清洗(qīngxǐ)转移（六）栽培3、移栽第二十九页，共49页。材料的移栽及温室培养：炼苗：先在外界(wàijiè)环境闭瓶锻炼3天，再开瓶锻炼3天（以培养基上开始长出菌为宜）。移栽：去净培养基，可先在灭过菌的珍珠岩或蛭石上培养使根系发达再转移到土壤中。第三十页，共49页。菊花(júhuā)炼苗菊花(júhuā)移栽苗第三十一页，共49页。1、外植体带菌2、培养基及接种器具(qìjù)灭菌不彻底3、接种(jiēzhòng)操作时带入4、环境(huánjìng)不清洁植物组培污染途径第三十二页，共49页。污染(wūrǎn)的预防措施（一）防止外植体带菌（二）保证培养基及接种器具彻底灭菌（三）操作(cāozuò)人员严格遵守无菌操作(cāozuò)规程（四）保证接种与培养环境清洁第三十三页，共49页。1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精(jiǔjīng)、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精(jiǔjīng)、酒精(jiǔjīng)灯——灼烧）4、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。思考(sīkǎo)：在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？第三十四页，共49页。组织培养原理(yuánlǐ)过程(guòchéng)意义(yìyì)利用植物细胞的全能性快速繁殖，培育无毒植株，培育作物新品种根芽植物体离体植物器官、组织或细胞(脱分化)愈伤组织(再分化)植物组织培养小结:操作条件含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等第三十五页，共49页。练习1.答：植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作(cāozuò)。2.答：外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。第三十六页，共49页。影响(yǐngxiǎng)植物组织培养的影响(yǐngxiǎng)因素

及注意事项影响植物组织培养的几个(jǐɡè)因素植物的材料培养基植物激素pH值外界因素（温度，光照，通气状况，材料处理等）第三十七页，共49页。【注意事项】1、实验所使用的器材必须要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；2、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次(zhúcì)加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机物质和铁盐溶液配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它两种种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；第三十八页，共49页。3、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；4、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死。5、所有制备好的溶液(róngyè)和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。第三十九页，共49页。组织培养实验室设置及设备(shèbèi)介绍（1）实验室设置(shèzhì)组织培养实验室设置(shèzhì)简图第四十页，共49页。（2）组培相关(xiāngguān)设备仪器介绍

电子天平纯水机第四十一页，共49页