人教版高中生物选修一5.3《血红蛋白的提取和分离》

课题3血红蛋白的提取和分离蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。1、分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。思考1.通过进行探究实验，结合观看实验视频，能够尝试从血液中提取和分离血红蛋白2.通过阅读资料，结合教师讲解，能够了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理1基础知识1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。性质：微小的多孔球体本质：多糖类化合物实例：葡聚糖、琼脂糖（一）凝胶色谱法2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3、具体过程较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快相对分子质量较小1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。3、配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。（二）缓冲溶液你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移过程。2、原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。（三）电泳②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3、类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS：消除净电荷对迁移率的影响。实验操作21、红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放3、分离血红蛋白溶液4、透析（一）样品处理1.红细胞的洗涤血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆析出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色问题：①刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？加入抗凝血剂，防止血液凝固。②洗涤的目的是什么？去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。③洗涤干净的标志是什么？直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：①蒸馏水的作用是_________________________。②加入甲苯的作用是_______________________。③充分搅拌的目的是_______________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白1、凝胶色谱柱的制作打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管2、凝胶色谱柱的装填固定色谱柱→配凝胶悬液→装填色谱柱→洗涤平衡3、样品的加入和洗脱调节缓冲液面→滴加透析样品→样品渗入凝胶床→洗脱→收集分装蛋白质（二）凝胶色谱操作样品的加入和洗脱1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱5.收集缓冲液凝胶1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3.凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。注意事项在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究。思考

如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？思考结果分析评价3观察你处理的血液样品离心后是否分层？若分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。

1.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？

2.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。若色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。若凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

3.你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定1、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（）A.电荷的多少B.分子的大小C.肽链的多少D.分子形状的差异B2、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（）A.弄清各种蛋白质的空间结构B.弄清各种蛋白质的功能C.弄清各种蛋白质的合成过程D.获得高纯度的蛋白质D3、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（）A.相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B.相对分子质量较小的蛋白质行程小于相