凝胶过滤层析20130510

凝胶过滤层析张春鸽20130510凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（sizeexclusionchromatography）、分子筛层析（MolecularSieveChromatography）、凝胶渗透层析（GelPermeationChromatography）定义应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐和脱色。凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。原理典型的凝胶类型琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel交联葡聚糖凝胶：Sephadex丙烯葡聚糖凝胶：Sephacryl葡聚糖和琼脂糖交联：Superdex固定相（凝胶）三维空间网状结构

样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出分子筛效应：按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。基本概念外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）分配系数（Kd）

Ve=Vo+KdVi(2)Ve=Vo+Vi，Kd=1分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1,最后流出(1)Ve=Vo，Kd=0分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里最先流出(3)0<Kd<1，Ve=Vo+ViKd为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关

Kd=00＜Kd<1Kd=1洗脱体积小分子量大分子量凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的选择2、凝胶的预处理3、层析柱的装填4、样品的准备5、上样6、洗脱和收集7、凝胶的再生及保存凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的选择要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、非特异吸附性质等。两种分离形式:一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。凝胶粒径的影响凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好同一流速下不同粒度的SephadexG-25柱的洗脱效果2、凝胶的预处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用一定体积蒸馏水浸泡24小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到沸水浴中加热接近100℃（煮1h)。根据干凝胶的填充体积计算所需的干凝胶量3、层析柱的装填1、选择合适的层析柱和填料；2、检查层析柱连通是否完好，加入纯化水，流通是否畅通，固定层析柱（注意不能倾斜）；3、待柱料沉降后量取柱料的体积，或者在层析柱中加入水，划线标出要装填的高度；4、在层析柱中装入1/5柱床体积的水，防止气泡的产生（直接将填料加入层析柱中很容易产出气泡）；5、填料一般存放在20%乙醇中，首先用过滤纯化水清洗填料，直接装填，容易产生气泡；6、打开层析柱下面的流通阀，准备装柱；7、清洗后填料尽量倒掉沉降后填料上的水，使填料的浓度大，尽量增加一起倒入的量，放置多次加入填料介质分布不均；（大概4体积的悬浮液=3体积的填料）8、填料装填结束后，要用20%的乙醇冲洗填料，增加层析介质的紧密性，提高分辨率（重力沉降法装的填料一般紧密性不够，分辨率低)3、层析柱的装填4、样品的准备样品的粘度：粘度大产生介质吸附，一般要求样品粘度小于0.01Pa·s样品的浓度：样品浓度过大往往导致粘度增大。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱样品的体积：分析用量一般应低于总柱体积的5%。

样品黏度对洗脱曲线的影响（1）加葡萄糖2000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使终浓度为1%.

5、上样打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶胶面具体步骤为：沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁加样时应尽量减少凝胶床面的搅动。4、洗脱和收集打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。洗脱时应注意的问题：流速不宜过快且要稳定洗脱液的成分也不应改变（凝胶溶胀程度）整个洗脱过程中始终保持一定的操作压可以用水或缓冲液作洗脱液

流速对洗脱曲线的影响

流速较低，分辨率较高5、凝胶的再生及保存再生

用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能，或参照凝胶产品说明书凝胶的保存方法

0.02%叠氮钠或20%乙醇凝胶过滤层析的特点优点：操作条件温和，样品回收率可接近100％，并且重复性高。作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白活性收率高；分离机