琼脂糖凝胶电泳及DNA纯化

实验二

琼脂糖凝胶电泳及DNA的纯化一、实验目的1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法2、掌握回收试剂盒纯化DNA的方法DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。注意事项：EB是有毒物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，三、实验材料、器具及药品电泳：实验一的PCR产物样品。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外凝胶成像系统等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液纯化：回收试剂盒四、实验步骤⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。⑵用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。⑶将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取PCR产物样品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。⑸打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。⑺将染色后的凝胶置于紫外凝胶成像系统上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。⑹将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。

琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围

常用的电泳缓冲液4℃保存备用.Ⅰ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液

Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液常用的6X载样缓冲液7、用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（≥300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶。8、使用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μL进行计算(100mg=100μL)。按照凝胶浓度，按下表提供的参数加入相应体积的bindingbufferII。均匀混合后60℃加热融化胶块。间断振荡混合，使胶块充分融化(约10分钟)。将融化的胶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中(吸附柱)，室温放置2分钟，12000rpm室温离心1min。（如果溶胶液大于750微升，则可多次上样）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500微升Washsolution，12000rpm室温离心1分钟重复步骤6一次取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心2分钟。将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加入40μLElutionBuffer放置2分钟。12,000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可以立即使用或保存于-20度使用。几点注意事项加以说明：加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品孔中的气泡。应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于So