核酸扩增仪及维护维修

末代沙皇尼古拉二世1918年的流行性感冒病毒电影《侏罗纪公园》以及辛普森杀妻案？第十三章

PCR核酸扩增仪

(PCRnucleicacidAmplifier)教学基本要求◆掌握核酸扩增仪的工作原理和主要性能指标。◆掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。◆掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类及特点。教学基本要求●熟悉PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。▼了解PCR扩增仪的操作规程；PCR扩增仪常见故障的排除；PCR扩增仪的应用。第一节

PCR核酸扩增仪的工作原理PCR（Polymerase

Chain

Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。简单的讲：PCR是一项在短时间内体外大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术一：PCR技术的发展简史PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……话说在1983年

春夏之交某个迷人的晚上

KaryB.Mullis在开车去乡下别墅的路上Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。二：PCR技术的原理PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR反应五要素引物（primer）

酶（TaqDNApolymerase）

dNTP

（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）PCR仪PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增重复30轮后230=1,073,741,824理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA三：PCR核酸扩增仪的工作原理PCR技术的本质是核酸体外扩增反应体系4种dNTP混合物引物模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+反应条件变性退火延伸PCR核酸扩增仪的工作原理PCR核酸扩增仪的工作关键是：温度控制PCR核酸扩增仪的工作原理控温方式水浴锅控温

压缩机控温

半导体控温

离心式空气加热控温

PCR仪器的变迁三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）电加热块＋自来水冷却（PE，1988）电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测(如Roche的Lightcycler)风（空气）加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）PCR核酸扩增仪的工作原理控温方式水浴锅控温

压缩机控温

半导体控温

离心式空气加热控温

特点水导热温度均一性好无边缘效应金属导热控温方便半导体导热高精度温控空气导热温度均一性好无边缘效应缺点体积大自动化程度低控温不稳定故障率高边缘效应严重overshootingundershooting仍有边缘效应温度均一性欠overshootingPerfectSofarBio-RadMJMini梯度PCR仪ABI7500荧光定量PCR仪Roche480荧光定量PCR仪半导体控温空气加热温控第二节

PCR核酸扩增仪的分类与结构第二节PCR核酸扩增仪的分类与结构普通定性PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪普通定性PCR核酸扩增仪按照变温方式分为以下三类：水浴式PCR仪变温金属块式PCR仪变温气流式PCR仪

——水浴式PCR仪一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。特点：仪器体积较大，但变温快、时间准、温度均一，目前应用较少。

——变温金属块式PCR仪一般由控温系统和人机交互系统组成

控温系统：中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。凹孔内壁加工精密，保证与样品管紧密接触。一般通过半导体加热和冷却，并由微机控制恒温和冷热处理过程

人机交互系统：通过键盘和显示器实现人机交流，并可编程、存储或删除程序。特点：仪器装置比较牢固耐用，温度变换平稳，有利于保持TaqDNA聚合酶的活性。

——变温气流式PCR仪由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。热源由电阻元件和吹风机组成，形成热空气枪借空气作为热传播媒介，由大功率风扇及制冷设备提供外部冷空气制冷，精确的温度传感器构成不同的温度循环。特点：仪器不用金属精密加工，成本较低；整个系统没有液体流动及制冷剂，安全程度高。配上微机和软件，可灵活编程。

普通定性PCR核酸扩增仪按照功能用途可分为以下两类：梯度PCR仪原位PCR仪

单细胞PCR仪

——梯度PCR仪由普通PCR仪衍生出的具温度梯度功能的核酸扩增仪。多种变性温度和延伸温度可在一台扩增仪上同时完成既节省实验时间、提高实验效率，又节约实验成本。梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，根据扩增结果，一步就可以摸索出最适退火条件。

54℃56℃58℃60℃62℃——原位PCR仪

是原位杂交与PCR技术的结合。在细胞内进行PCR扩增，而不破坏组织细胞的形态。解决了以往手工方法操作复杂，扩增效果及实验结果重复性不理想的问题。与普通PCR仪的区别：其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。德国peqlab

peqSTAR

原位PCR仪

——单细胞PCR仪

进行单细胞PCR扩增所必须单细胞PCR反应专用plate经流式细胞仪分选的单细胞单细胞PCR仪第二节PCR核酸扩增仪的分类与结构普通定性PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪ABI7500荧光定量PCR仪

MJ公司Chromo4荧光定量PCR仪

Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR，RQ-PCR)技术是在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号达到定量的目的。实时荧光定量PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪的核心结构：PCR系统和荧光检测系统。

PCR系统：

荧光检测系统：主要包括激发光源和检测器。现在的主流是多色多通道检测，激发通道越多适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽。实时荧光定量PCR核酸扩增仪金属板式实时荧光定量PCR仪离心式实时定量PCR仪各孔独立控温的荧光定量PCR仪

金属板式实时荧光定量PCR仪即传统的96孔板式定量PCR仪，由第三代的半导体PCR仪发展而来，在原位PCR仪的基础上，增加荧光激发和检测模块，升级为荧光定量PCR仪。可作普通PCR仪使用，带梯度功能，但温度均一性差，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。

金属板式实时荧光定量PCR仪激发光源多为卤钨灯，与5色滤光镜配合，可同时激发96或384个样品；检测器为超低温CCD成像系统，可同时多点多色检测，能有效分辨FAM／SYBRGreenI、VIC／JOE、NED／TAMRA／Cy3等多种荧光染料。随机配制的定量PCR引物和探针设计软件PrimerExpress可以设计定量PCR所需的TaqMan探针。有实时动态(Real-Time)和终点读板(PlateRead)两种模式。实时荧光定量PCR核酸扩增仪金属板式实时荧光定量PCR仪离心式实时定量PCR仪

各孔独立控温的荧光定量PCR仪

离心式实时定量PCR仪离心式实时定量PCR仪器的样品槽被设计为离心转子的模样，借助空气加热，转子在腔内旋转，每个样品孔之间的温度差异小于0.01℃，保障了标准曲线和样品之间反应条件的一致性。激发光源大多采用发光二极管(LED)冷光源，运行前无需预热，无需校正。系统误差少，定量线性范围可达l0个数量级。缺点：离心转子小，可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能。

离心式实时定量PCR仪Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪

LightCycleTM荧光定量PCR仪

离心式实时定量PCR仪LightCycleTM荧光定量PCR仪结构示意图

实时荧光定量PCR核酸扩增仪金属板式实时荧光定量PCR仪离心式实时定量PCR仪各孔独立控温的荧光定量PCR仪

各孔独立控温的荧光定量PCR仪各孔独立控温的定量PCR仪设计非常独到，不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，可以在同一台定量PCR仪上分进行不同条件的定量PCR反应，随时利用空置的样品槽开始其他定量反应，使用效率非常高。升降温速度高达10℃／s，控温精度高。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触，保证荧光激发和检测不受外界干扰。各孔独立控温的荧光定量PCR仪该类仪器整合多通道光学检测系统，能有效分辨多种荧光染料，可对同一样品进行多靶点分析，同时检测四种荧光信号。可使用Taqman探针、分子信标、Amplifluor引物等多种检测方法，定量线性范围可达9个数量级。其软件允许一台仪器同时操作多个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。缺点：上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。适合多指标快速检测，但目前在国内应用尚少。荧光检测系统

激发光源

检测器

发光二极管

卤钨灯光源

超低温CCD

光电倍增管如何选择荧光定量PCR仪器？

1、仪器使用的广泛程度

2、仪器的检测通量（反应孔数）

3、仪器的通道数量

4、耗材的开放性

5、硬件设计特点

6、运行速度

7、灵活性

进口定量PCR仪器厂商ABIROChe

（罗氏）Bio-Rad（伯乐）市场占有率市场价格ABIROCheBio-RadABI荧光定量PCR仪厂家介绍：美国应用生物系统公司，经营生产生命科学设备仪器和试剂，其荧光PCR仪成系列，市场占有率高。荧光PCR仪型号：ABI7500﹥ABI7300ABI7900ABIsteponeABIViiA7﹥﹥﹥代理公司：达安基因，上海创萌，创博环球，北京博凌科为，北京优尼康，北京鼎盛伟业等ROChe厂家介绍：罗氏公司始创于1896年，总部位于瑞士巴塞尔，主要涉及药品、医疗诊断、维生素和精细化工、香精香料等四个领域。LightCycler以运行速度快而著称，在国内市场占有率单款最高

荧光PCR仪型号：LightCycler2.0﹥LightCyclerLightCycler480LightCyclerNano

﹥﹥代理公司：上海浩然，达安基因，上海博尼，山东艾克韦，济南朋远，北京博凌，上海众华，北京普生瑞等

Bio-Rad厂家介绍：伯乐自1952年在美国成立，在50多年中为临床诊断和生命科学研究市场提供了广泛的新型产品和服务，始终居于科学发现的中心地位。荧光PCR仪型号：Chromo4

Opticon2

CFX96

IQ5

代理公司：上海劢瑞，上海甄明，创博环球，北京赛伯乐，黑龙江万联顺等

国产RT-qPCR仪

达安基因DA杭州博日FQD厦门安普利GeneLight上海宏石SLAN第三节PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规程

及常见故障的排除PCR核酸扩增仪的性能指标PCR核酸扩增仪的操作规程PCR核酸扩增仪常见故障的排除PCR核酸扩增仪的性能指标温度控制温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性，是PCR反应最重要的影响因素之一，直接关系到实验的成败。温度的均一性是指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。如：“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。升降温的速度升降温速度快，能缩短反应进行的时间，提高工作效率，提高PCR反应特异性。