分子生物学第115章原核基因转录水平的调控

11.5.1原核生物基因的表达调控11.5.2原核生物基因启动子的一般结构11.5.3原核生物基因的转录过程11.5.4乳糖操纵子表达的调控机制11.5.5色氨酸操纵子表达的调控机制

11.5原核基因转录水平的调控组成型表达和调节型表达

在细胞中，有些基因产物的量是比较恒定的，它们是细胞维持代谢必需的物质，如糖酵解途径中的酶及组成核糖体的蛋白质，这类基因的表达称为组成型表达（constitutiveexpression）；有些基因产物的量在不同的情况下变化很大，需要这类产物时基因表达，不需要时基因关闭，这类基因的表达称为调节型表达（regulatedexpression）。真核与原核细胞转录与翻译调控特点的比较转录水平上的调节方式①

代谢产物对基因表达的调节②

衰减子对基因表达的调节③

降解物对基因表达的调节④

细菌的应急反应

1.代谢产物对基因表达的调节

在降解代谢途径中，起始端的酶的底物浓度往往决定是否合成这一途径中后续的各种酶（诱导）；而在合成代谢中，最终产物往往是调节物质（阻遏）。这些调节物质必须与反式作用因子结合才能起到调节基因表达的作用。

2.衰减子对基因表达的调节

在这种调节方式中，起信号作用的是特定氨酰－tRNA的浓度，如对色氨酸操纵子来说，高浓度的色氨酰－tRNA抑制色氨酸操纵子的表达。具有这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子和缬氨酸操纵子，以及沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子、嘧啶合成操纵子等。3.降解物对基因表达的调节

在有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其对应的操纵子也不会启动，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。这时，细菌所需的能量可以从葡萄糖得到满足，而无须启动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。降解物对基因表达的调节

其机制是葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶，减少cAMP的合成，cAMP受体蛋白因不能与cAMP结合而不能形成复合物。这种复合物是一个正调节物质，它可与操纵子上的启动子区结合，促进基因转录的启动。若培养基中缺乏葡萄糖，而有其它种类的糖，相应的操纵子就会启动。4.细菌的应急反应

上述3个方面是细菌处于正常生活条件下的基因表达调节方式，这种正常也包括生活环境中缺少某一种或两种物质，但能找到代用物。可是，细菌有时会遇到十分恶劣的环境，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一两种氨基酸，而是氨基酸全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌会产生应急反应，包括合成各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生化反应过程均被停止。细菌的应急反应

当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上，ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因。ppGpp的作用原理还不清楚，它不只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批操纵子，所以它是超级调控因子。原核基因启动子的一般结构

原核生物基因的启动子有两个保守的区域，一个位于－10处，称为Pribnowbox，另一个位于－35处，称为Sextamabox。它们的保守性为SextamaboxPribnowboxT82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T96

通过缺失分析发现，强启动子Pribnowbox和Sextamabox之间的间隔为17±1bp，增大或减小这个间距能明显影响启动子的强度。几种原核基因的启动子原核生物的RNA聚合酶

原核细胞中只有一种RNA聚合酶，它催化所有种类RNA的合成。真核细胞中有三种RNA聚合酶，分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，它们催化合成的RNA种类不同。大肠杆菌RNA聚合酶

大肠杆菌RNA聚合酶通常认为由5个亚基组成，即α2、β、β＇及σ，这5个亚基组成的酶叫全酶，而只由α2、β、β＇4个亚基组成的酶叫做核心酶。此外，还可以看到一个相对分子量在10000左右的ω亚基，其功能尚不清楚；后来又发现一个分子量为69000的酸性蛋白，称为NusA蛋白，现在又称为转录延伸因子，其功能可能与RNA转录的延伸和终止有关。大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的功能

σ亚基的主要功能是识别启动子；α亚基的主要功能是参与和启动子的结合、DNA双链的解链和恢复双螺旋；β亚基可能参与底物的结合及RNA合成时磷酸二酯键的形成；β＇亚基的碱性最强，可能起到与DNA模板结合的作用。RNA的转录过程

原核RNA聚合酶通过σ亚基发现启动子－35区识别位点后，首先与－35区序列结合成一个封闭的启动子复合体，几乎与此同时，全酶向－10序列转移并与之紧密结合，使－10区及转录起始区发生局部解链而形成开放型复合体。转录起始RNA的转录过程

在开放型复合体中，RNA聚合酶上的起始位点和延伸位点分别被两个相应的核苷三磷酸按碱基配对原则占据（起始位点只允许嘌呤核苷三磷酸进入），在β亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，这样就形成了一个RNA聚合酶—DNA—新生RNA的三元复合体。三元复合体一旦形成，σ亚基就从全酶上解离下来，此时转录起始完成，进入延伸阶段。转录起始转录起始过程RNA的转录过程RNA合成的速度大约每秒30～50个核苷酸。转录延伸RNA的转录过程

原核基因转录的终止机制比较清楚。以大肠杆菌为例，转录的终止需要一个信号，这个信号就是一个叫做转录终止区或终止子（terminator）的DNA序列。终止子序列存在于已被RNA聚合酶转录过的序列中。

转录终止终止子的类型

已知有两类终止子：一类是不依赖蛋白辅助因子而能实现转录终止的终止子，叫做ρ-非依赖性终止子；另一类是依赖蛋白辅助因子ρ才能实现转录终止的终止子，叫做ρ-依赖性终止子。ρ-非依赖性终止子ρ-非依赖性终止机制

ρ-非依赖性终止子不是在DNA水平上终止转录的，而是在已转录产生的RNA水平上发生作用的。终止子序列从DNA模板上转录后，在新生RNA链中产生发卡结构，在发卡结构后面跟着大约由6个U组成的序列。这两种结构都为转录终止所必需。如果在发卡区产生突变，破坏其发卡结构，会妨碍转录终止。RNA聚合酶在发卡处通过相互作用使RNA转录停滞，而一连串的U提供了使RNA聚合酶从模板上解离下来的信号而使转录终止。ρ-依赖性终止子

在ρ-依赖性终止子中，转录终止点前也有发卡结构，但发卡结构中GC对含量较少，发卡结构的下游序列没有固定的特征，其AT对含量比ρ-非依赖性转录终止子低。ρ-因子利用其NTP酶活性产生的能量，结合到RNA链上，然后沿着RNA链滑向RNA聚合酶，当RNA聚合酶在发卡结构处停滞时，ρ-因子与RNA聚合酶相互作用而终止转录。ρ依赖性终止机制RNA聚合酶正在转录ρ因子附着到RNA的识别位点上ρ因子沿RNA移动，追赶RNA聚合酶在终止子处，ρ因子与RNA聚合酶相互作用在转录泡处，ρ因子使DNA-RNA杂交双链解旋转录终止终止子的终止效率

ρ-非依赖性转录终止在有ρ-因子参与时，终止效率提高；终止子序列发卡结构中GC含量高时，终止效率高。Thesequencesrequiredforrho-dependenttermination(sometimescalledrutsites)are50-90baseslongandlieupstreamoftheactualterminationsite.TheircommonfeatureisthattheRNAisrichinCresiduesandpoorinGresidues.Cisbyfarthemostcommonbase(41%)andGistheleastcommonbase(14%).Asageneralruletheefficiencyofarut

siteincreaseswiththelengthoftheC-rich/G-poorregion.Rut位点的序列特征Arut

sitehasasequencerichinCandpoorinGprecedingtheactualsite(s)oftermination.Thesequencecorrespodnstothe3¢endoftheRNA.乳糖操纵子

乳糖操纵子控制3个酶的表达。即lac

Z、lac

Y、lac

A，它们分别编码β－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷透过酶和β－半乳糖苷乙酰基转移酶。由于多顺反子mRNA中各基因翻译效率的不同，β-半乳糖苷酶：β－半乳糖苷透过酶：β－半乳糖苷乙酰基转移酶合成的比例为1：0.5：0.2。大肠杆菌如果以乳糖为唯一碳源和能源的话，前两种酶是必需的。

lacoperonlacA的可能作用NodefectisidentifiableinlacA-

cells,whichispuzzling.Itispossiblethattheacetylationreactiongivesanadvantagewhenthebacteriagrowinthepresenceofcertainanalogsofb-galactosidesthatcannotbemetabolized,becausethemodificationresultsindetoxificationandexcretion.乳糖操纵子的表达调控

在不含乳糖及β－半乳糖苷的培养基中，lac+基因型大肠杆菌细胞内β－半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞内大约只有1～2个酶分子，这称为本底表达。但是，如果在无葡萄糖的培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6～7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。乳糖操纵子的表达调控半衰期长半衰期长乳糖操纵子的人工诱导物和底物

实际研究中，很少使用乳糖作为诱导剂，因为培养基中的乳糖会被诱导产生的β－半乳糖苷酶降解，使乳糖的浓度不断下降。实验室里常常使用两种含硫的乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）或甲基硫代半乳糖苷（TMG）作为诱导剂。在酶活性分析中常用O－硝基苯半乳糖苷（ONPG）作为生色底物。乳糖操纵子的

人工诱导物和活性测定底物

诱导物诱导物生色底物O-硝基苯半乳糖苷(ONPG)乳糖操纵子的发现

1940年，JacquesMonod等开始研究大肠杆菌中乳糖代谢的可诱导性。他们发现乳糖或其他半乳糖苷能够诱导β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）的表达。可是，有些突变体能够被诱导出β－半乳糖苷酶，但仍不能在仅含乳糖的培养基中生长。他们将放射性标记的半乳糖苷加到野生型和突变型的大肠杆菌中，并分别进行诱导和非诱导，发现在诱导条件下，野生型可以吸收半乳糖苷，而突变型（Y－）不能吸收半乳糖苷。Effectof

CrypticMutant（lzcY－）onAccumulationofGalactosideGenotypeInducerAccumulationofGalactosideZ+Y+－－Z+Y+＋＋Z+Y－－－Z+Y－＋－对突变体的生物化学研究

Monod认为有一种物质负责将半乳糖苷运入细胞，Y－突变型产生这种物质的基因有缺陷。他将这种物质命名为半乳糖苷透过酶（galactosidepermease）。在纯化半乳糖苷透过酶时，Monod等又发现了半乳糖苷转乙酰基酶（galactosidetransacetylase）到上世纪50年代末期，Monod发现这三种酶被半乳糖苷同时诱导出来，因此至少有三个基因被同时诱导表达。他还发现了一些突变体，这些突变体不需要诱导就能持续表达这三种酶。这些突变体称为组成型突变体（constitutivemutants）。对突变体的遗传学研究

Monod认识到，遗传学分析可以大大促进研究的进展，于是他请同在巴斯德研究所的FrancoisJacob参加到他的团队中。在ArthurPardee的协助下，Jacob和Monod制作了大肠杆菌部分二倍体（merodiploids），这些部分二倍体携带了野生型基因（可诱导的）和组成型突变体的等位基因。实验表明野生型基因是显性的(即组成型突变基因也不表达)，说明野生型细胞可以产生一种物质，它使得基因关闭，除非被诱导。这种物质被称为阻遏蛋白（repressor），组成型突变体不能产生这种阻遏蛋白，野生型基因产生的阻遏蛋白可以抑制组成型突变基因的表达。这些组成型突变体记为lacI－。Mutantrepressorgene（I－）NolacproductsinabsenceoflactoseNolacproductsinabsenceoflactoseBothlacoperonsrepressible；mutationisrecessive.（Inmerodiploidcells）对突变体的遗传学研究阻遏蛋白要发挥作用，应该结合到DNA的特殊序列上，Jacob和Monod将这种特殊序列称为操纵区（operator）。可以想象，即使有阻遏蛋白，操纵区突变，阻遏蛋白无法与操纵区结合，也会使得三种酶组成型表达。区分这两种突变的方法是：在部分二倍体细胞中，如果是阻遏蛋白基因突变（I

－），不产生阻遏蛋白，表型是隐性的（recessive）；如果是操纵区突变（Oc），突变基因成为组成型表达，表型是显性的，这种显性称为顺式显性（cis-dominant），而野生型基因仍须诱导才能表达。Mutantoperator（O

c）NolacproductsinabsenceoflactoselacproductsinabsenceoflactoseOnelacoperonnonrepressible；mutationiscis-dominant.（Inmerodiploidcells）对突变体的遗传学研究有一种阻遏蛋白突变，突变的阻遏蛋白不能与诱导物结合，因此结构基因经诱导也不能表达。这种突变称为I

s，这种突变是顺反都显性的。NolacproductsinpresenceorabsenceoflactoseNolacproductsinpresenceorabsenceoflactoseBothlacoperonsuninducible；mutationiscis-andtrans-dominant.对突变体的遗传学研究还有一种阻遏蛋白突变，突变的阻遏蛋白不能与操纵区结合，结构基因组成型表达，这种突变称为I－d，这种突变叫显性阴性（dominantnegative）。lacproductsinabsenceoflactoselacproductsinabsenceoflactoseBothoperonsnonrepressible；mutationisdominantnegative.乳糖操纵子概念的提出

通过熟练的遗传学分析，Jacob和Monod提出了操纵子的概念。他们预言有两个关键的控制元件存在：阻遏蛋白基因和操纵区。缺失突变揭示了第三个元件——启动子，它对三个结构基因的表达是必需的。他们得出结论，三个结构基因是成簇排列，并处于一个控制单位的控制之下，即乳糖操纵子。随后的生化研究证实了他们完美的假说。lacrepressor的纯化

20世纪60年代，Gilbert和Muller-Hill成功地部分纯化了lac阻遏蛋白。开始时采用标记的IPTG与阻遏蛋白结合的方法来检测阻遏蛋白，但因Lac阻遏蛋白含量非常低，无法检测到。后来从一个突变体lacI

t中纯化出了阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与IPTG结合非常紧密，这样就能从粗提物中检测到阻遏蛋白。lacrepressor与operator的结合

Cohn和他的同事用纯化的阻遏蛋白进行与operator的结合实验。他们将含有lacoperator的标记DNA片段加到固定有不同量的repressor的硝酸纤维素滤膜上，然后测定滤膜上结合的DNA的量，并在加和不加IPTG两种情况下实验，得到如下结果：

Assayingthebindingbetweenlacoperatorandlacrepressor不加IPTG加IPTGTheOclacoperatorbindsrepressorwithloweraffinitythandoesthewild-typeoperator含正常operator的DNA片段含Oc突变operator的DNA片段Λφ80DNA片段（对照）Pastan等的实验早在1971年，Pastan及其同事就通过实验证明：即使repressor存在，RNA聚合酶也能够紧密地结合到promoter上。他们的实验是：在repressor存在下，将含有operator的DNA片段与RNA聚合酶保温，然后同时加入诱导剂IPTG和利福平。利福平能够抑制转录，除非已经形成了开放的启动子复合物。结果转录发生了，说明repressor没有阻止开放启动子复合物的形成。即使有了这个实验结果，人们还是认为repressor与operator的结合阻碍了RNA聚合酶与启动子结合，从而抑制转录。转录起始开放复合物的形成Straney和Crothers的实验

1987年，Straney和Crothers用实验强化了这个观点：RNA聚合酶和阻遏蛋白可以同时结合到lac启动子上。他们提出，尽管阻遏蛋白不影响RNA聚合酶与启动子的结合，但阻止开放复合物的形成。

这个观点与Pastan等人的实验结果不符。Krummel和Chamberlin的观点

Krummel和Chamberlin提出另外一种解释：阻遏蛋白阻止从起始转录复合物状态转变成延伸状态。换句话说，阻遏蛋白可以合成短的RNA，但不能继续合成RNA。Lee和Goldfarb的实验

Lee和Goldfarb提出了实验证据支持了Krummel和Chamberlin的观点。他们用run-off转录分析法证明，即使在阻遏蛋白存在下，RNA聚合酶也已经与DNA模板发生了相互作用。实验方法如下：

将阻遏蛋白与含有lac控制区域及lacZN端部分序列的123bp的DNA片段保温10分钟，使阻遏蛋白与operator结合，然后加入RNA聚合酶，再加入肝素及RNA聚合酶反应所需的其他全部成分（除CTP外）。肝素结合到游离的或与DNA松散结合的RNA聚合酶上，阻止这些RNA聚合酶与DNA紧密结合，但并不影响已经与DNA紧密结合的RNA聚合酶。最后加入标记的CTP，同时加和不加IPTG。Lee和Goldfarb的实验结果-runofflacR－++IPTG－－+Run-off：合成一小段结构基因的RNA

结果表明，阻遏蛋白不能阻止RNA聚合酶与启动子形成开放复合物。Lee和Goldfarb还注意到，在阻遏蛋白存在时，有一个仅6个核苷酸长的不全转录物（abortivetranscripts）产生。这说明阻遏蛋白实际上是抑制了从产生不全转录物的无效转录到连续转录这个转变过程。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1965"fortheirdiscoveriesconcerninggeneticcontrolofenzymeandvirussynthesis"FrançoisJacobAndréLwoffJacquesMonodInstitutPasteur,Paris,France乳糖操纵子的阻遏调控

lacI的表达产物是四聚体的阻遏蛋白（repressor），它结合到乳糖操纵子的操纵区（operator），使转录不能进行。当有诱导物（inducer）存在时，诱导物与阻遏蛋白结合，结合的复合物不能与操纵区结合，转录得以进行。乳糖操纵子的阻遏调控

实际上，以乳糖为诱导物时，并不是乳糖和阻遏蛋白结合，而是由乳糖（半乳糖－β－1,4－葡萄糖）的异构体异构乳糖（半乳糖－β－1,6－葡萄糖）与阻遏蛋白结合。由乳糖转变成异构乳糖是由β－半乳糖苷酶催化的。在β－半乳糖苷酶催化下，多数乳糖降解成葡萄糖和半乳糖，也生成一些异构乳糖，使得操纵子处于开放状态。乳糖操纵子的阻遏调控Operator的结构-5+21乳糖操纵子的三个OperatorMajoroperatorAuxiliaryoperatorAuxiliaryoperator乳糖操纵子的三个Operator

缺失对基因表达的影响右边的数字是加inducer与不加inducer时β－半乳糖苷酶活性之比阻遏蛋白四聚体结合到两个operator上使DNA成环DNA弯曲成环提高了阻遏的效率乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应

当培养基中有葡萄糖存在时，细胞吸收葡萄糖，葡萄糖与半乳糖苷透过酶结合，阻止乳糖吸收。这叫诱导物排斥（inducerexclusion）。InducerExclusionThekeymolecularcomponentininducerexclusionisthePTS(phosphoenolpyruvate:glucosephosphotransfer-asesystem),acomplexofproteinsinthebacterialmembrane,whichsimultaneouslyphosphorylatesandtransportssugarsintothecell.Oneoftheproteinsofthiscomplex(II

AGlc,whichiscode

dbythecrr

gene)becomesdephosphorylatedasaresultofglucosetransport.ItthenbindstotheLacpermeaseandpreventsitfromimportinglactoseintothecell.葡萄糖抑制乳糖输入乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应

除了抑制乳糖吸收外，葡萄糖还通过另一种机制阻止乳糖操纵子表达。PTS中的II

AGlc在磷酸化状态时刺激腺苷酸环化酶的活性，使ATP转变成cAMP，当介质中有葡萄糖时，II

AGlc在输入葡萄糖的过程中，本身被脱磷酸化，脱磷酸化的II

AGlc降低腺苷酸环化酶的活性，使cAMP减少。而cAMP也是乳糖操纵子表达的必需因子。这是乳糖操纵子表达的另一种调控机制。乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应

cAMP可与其受体蛋白CAP（cataboliteactivatorprotein，也叫cyclicAMPreceptorprotein，CRP）结合，形成复合物，结合到乳糖操纵子的启动子区域，从而使得RNA聚合酶能够与启动子结合，转录得以进行。没有cAMP－CAP复合物与启动子的结合，RNA聚合酶不能结合到启动子上。

很多操纵子的转录需要cAMP－CAP复合物的参与，尤其是那些－10和－35序列保守性不强的启动子。乳糖操纵子启动子上

CAP与RNA聚合酶的顺序结合乳糖操纵子启动子上的CAP结合位点CAP与结合位点结合后使DNA发生弯曲负调控和正调控

Innegativeregulationarepressorproteinbindstoanoperatortopreventagenefrombeingexpressed.

InpositiveregulationatranscriptionfactorisrequiredtobindatthepromoterinordertoenableRNApolymerasetoinitiatetranscription.调节蛋白的几种作用方式调节蛋白的几种作用方式色氨酸操纵子

色氨酸操纵子负责色氨酸的生物合成，它的表达与否根据培养基中有无色氨酸而定。当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子打开。

色氨酸操纵子的组成

色氨酸的合成分5步完成。每一步需要一个酶，编码这5种酶的基因是紧密连锁在一起的，这5个基因被转录在一条多顺反子mRNA上。这5个基因分别称为trpE、trpD、trpC、trpB、trpA，它们分别编码了邻氨基苯甲酸