分子诊断学5学分-蛋白质组学

蛋白质组学（Proteomics）中山一院检验医学部陈培松Whichistheoriginoflife？一、背景二、基本概念（掌握）三、特点四、内容和技术五、应用——omics？一、产生背景1.20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。2.随着人类基因组全序列测定，但基因本身不足以解读复杂的生命现象。生命科学跨入了后基因组时代。Genome基因组研究是静态研究，序列信息并不能告诉人们哪些基因在何时何地以何种程度表达，而生命的精确机制很大程度上正是基于这类基因的精确调控。TranscriptomemRNA丰度与蛋白质丰度的相关性差。mRNA自身存在贮存、转运、降解、翻译调控及产物的翻译后加工，难以准确地反映基因的最终产物基因功能的真正执行体——蛋白质的质与量。蛋白质存在复杂的翻译后修饰（磷酸化、糖基化、乙酰化）。蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等也无法从mRNA水平来判断ProteomeDNAmRNAProtein蛋白质组（proteome）是指特定细胞、组织、乃至机体作为一个生命单元中所有蛋白的合集，即生命体中携带的基因信息在某一时间段所表达的所有蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是对在特定时间和环境下所表达的群体蛋白质研究的一门学问二.概念

蛋白质组(Proteome)一词最早由澳大利亚学者Ｗｉｌｋｉｎｓ等于1994年提出。同基因组学一样,蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式,其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等,最终揭示蛋白质功能,是基因组ＤＮＡ序列与基因功能之间的桥梁。三.蛋白质组学研究的特点（1）整体性生命活动依赖于各种蛋白的协调合作（2）揭示生命的动态性过程同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也是在不断改变的。在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其变化与正常生理过程的也不同。（3）体现生命现象的复杂性基因表达的精密多层次调控Glucocorticoidreceptor（GR）,

CodingGene：NR3C1四.蛋白质组学的研究内容及技术表达蛋白组学（2-D电泳）结构蛋白组学（晶体结构分析）功能蛋白组学（EMSA,COIP等）五、蛋白质组研究的相关技术（一）蛋白质的分离

1.二维凝胶电泳（twodimensionalelectrophoresis，2-DE）。

2.操作（1）等电聚焦凝胶电泳（2）SDS电泳（3）图像分析

（二）2-D胶上蛋白质鉴定和测序（1）早期Westernblot鉴定（2）质谱技术MS是样品分子离子化后，根据不同离子间的质量、电荷比值差异来确定相对分子质量的技术。电喷雾离子化（eletrosprayionozation，ESI）和基质辅助的激光解吸离子化（MALDI）。（3）Edman降解法鉴定（4）蛋白质组信息学WesternBlottingImmunalBlotting印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。→Northern印迹法→Western印迹法免疫标记技术ElisaWesternBlottingImmunohistochemistryInsituhybridization蛋白质转印十二烷基磺酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）固相免疫测定SDS在缓冲液中添加SDS的电泳系统称为SDS(十二烷基硫酸钠）胶片电泳SDS是一种离子性的界面活性剂,带强的负价，可以使蛋白本身带的电荷忽略不计决定不同蛋白质的泳动速率就只剩下分子大小一项因素转印/印记蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜（NC）或者PVDF膜上三明治封闭印迹首先用蛋白溶液（如10％的BSA/脱脂奶粉）→一抗特异性的结合抗原（一抗孵育）二抗孵育适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。显色/发光印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。比较蛋白的差异性表达（三）蛋白质分子结构分析1.实际测定具体蛋白质的三维结构：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。

X-射线单晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。局限性：晶体2.通过氨基酸序列知识去辨识和推引出其决定的三维结构（1）用分子力学、分子动力学的方法，根据理化的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。（2）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。

1.研究蛋白质组的高通量方法。分别收集细胞不同区域内蛋白质，然后进行2-D电泳和蛋白质鉴定。2.将胞内特定蛋白质进行荧光标记，然后在荧光显微镜下进行观察蛋白质移位。（四）研究蛋白质胞内分布及移位的方法（1）凝胶滞后实验（gelretardation）（2）DNAaseI足纹分析（DNAaseIfootprinting）（3）核酸—蛋白质杂交实验（五）蛋白质—核酸相互作用的研究凝胶滞后实验（gelretardation）凝胶滞后实验（gelretardation）DNAaseI足纹分析（DNAaseIfootprinting）核酸—蛋白质杂交实验（southwesternblot）（六）蛋白质之间的相互作用蛋白质相互作用的基本形式（1）分子和亚基的聚合（2）蛋白分子杂交（3）分子识别（4）分子自我装备（5）多酶聚合体蛋白质相互作用的检测方法生化方法

●共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析●蛋白质亲和色谱

基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来2.免疫的方法免疫共沉淀（COIP）3.酵母双杂交系统优点：（1）蛋白质不必纯化（2）在活体内进行，能真实模拟在体的情况（3）可以检测短暂或者微弱的相互作用（4）可以用于分析不同功能的蛋白缺点：（1）定位于核内（2）假阳性（3）需要进一步确证蛋白质组学研究的应用1.用于寻找疾病相关的蛋白质：标志物。2.用于微生物蛋白组研究，彻底阐明病原微生物的致病机理并寻找全新的药物作用靶点。3.蛋白质组数据库将成为药物设计的路标。4.对不同生物的蛋白质组进行比较性研究，可以对生物进化途径提供参考，对多细胞生物的起源提供线索。5.追踪胞内信号分子的移位，阐明目标蛋白质在信号转导途径中的位置。Screenthedifferentiallyexpressedproteins2-DElectrophoresisScreenthedifferentially

expressedproteinspotsproteinextractCollectspecimenscancerNCMBiomarkerfordiagnosistreatmentandprognosisMS(ESI-MS-MS)identificationUnknownknown