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微生物学检测国家城市供水水质监测网郑州监测站二○一三年一月八日常规日检指标检测方法要点微生物学检测基础及要点313332目录微生物学指标检测方法要点1、采样容器一、微生物学检测基础及要点（一）样品的采集采集使用过消毒剂水样的采样容器应在清洗晾干后加入硫代硫酸钠等试剂；采样容器的瓶盖应使用牛皮纸/锡纸等进行包裹，并用绳子固定；采样容器应经过160℃的干热灭菌处理；采样容器在采样前不可荡洗。2、采样过程从龙头采集样品时，应放水至少2分钟后再取样，保证样品具有代表性；采集微生物指标样品前应对龙头进行消毒；采样过程中应避免对瓶口及瓶塞造成污染；采集的微生物样品应在4小时内进行检测。一、微生物学检测基础及要点（二）样品的检测1、检测环境2、相关设备无菌室、缓冲间、操作间；紫外线消毒30分钟，消毒后再过20分钟才能进入；缓冲间配备有专用的衣帽鞋。干燥箱；培养箱；高压灭菌器；冰箱；紫外灯；微生物检测过滤器；显微镜等。一、微生物学检测基础及要点（二）样品的检测3、试剂配制4、检测过程按照标准检测方法自行配置；购买成品的培养基，按照说明书进行配置；所有试剂均应采用适当的方式进行消毒处理；试剂配置过程中不得随意离开。检测前应做好个人卫生的处理，尤其是应用肥皂进行手部清洗；检测程序要严格按照作业指导书进行操作；检测中所有接触样品的器具使用前均应进行灭菌处理。一、微生物学检测基础及要点（二）样品的检测5、检测辅助记录6、质控措施采样容器、平皿、吸管、培养基等的消毒记录；无菌室的环境监控记录；废弃物的处理记录；培养箱、冰箱、紫外灯等的监控记录。每批样品至少做一个环境、培养基空白样品；每批样品平行样不得少于10%，至少两个；定期进行环境空白、试剂空白的检测；采样菌种、微生物质控试剂进行质控检测。常规日检指标检测方法要点微生物学检测基础及要点313332目录微生物学指标检测方法要点大肠埃希氏菌检测总大肠菌群检测31菌落总数检测333234耐热大肠菌群检测二、微生物学指标检测方法要点“两虫”检测35总大肠菌群检测31二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测311、总大肠菌群概念

总大肠菌群系一群在37℃培养24h至48h能够发酵乳糖、产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。总大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为该菌群细菌可包括埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属等。2、总大肠菌群的来源

总大肠菌群分布较广，调查研究表明，主要来自人和温血动物粪便，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因；同时，总大肠菌群还可能来自植物和土壤，在营养丰富的水体中检出，即在非粪便污染的情况下，也有检出的可能性。二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测314、总大肠菌群的限值

GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定，任意100mL水样中不得检出总大肠菌群.3、总大肠菌群的检测意义

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示饮用水中是有否粪便污染。当饮用水受到粪便等污染时，一般除了会有正常菌群外，还可以推测出饮用水中存在着肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌等）污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁。而从水中直接检验肠道致病菌不仅方法复杂，需时间长且也不一定能分离出来。所以在实际工作中，常采用机体肠道内的某些正常菌群，作为水被粪便污染的标志，进而标志饮用水中被肠道致病菌污染的可能性（存在风险）。一般地说，总大肠菌群能够指示肠道传染病菌存在的可能性，但它不是专一的指示菌。二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31

总大肠菌群的测定，GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定有三种方法：发酵法、滤膜法、酶底物法。一般来说，发酵法适用于饮用水、水源水尤其是浊度较高的水样，滤膜法适用于饮用水及浊度低的水源水水样。（一）多管发酵法（检验程序）乳糖初发酵实验复发酵实验分离培养结果报告具体操作详见GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》。操作过程中注意以下要点：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测312、革兰氏染色实验

由于微生物细胞含有大量水分，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,必须进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌。（1）染色原理（2）革兰氏染色步骤

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察

检测已处理的出厂水或清洁水时可以直接接种5管10mL水样双料培养基；检测水源水或污染较严重水样时，应加大稀释度，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。1、初发酵实验二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31A.涂片

取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。

在涂片薄膜上滴加染色液（草酸铵结晶紫）一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。后水洗。B.干燥

涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。C.固定D.染色二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31E.媒染

加革兰氏碘液媒染1min后，水洗。

用复染剂（沙黄复染液）复染1min，水洗。

用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥后镜检。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。F.脱色

斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20~30s，随即水洗。G.复染H.干燥二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31大肠杆菌（Escherichiacoli）革兰氏染色图革兰氏染色阴性杆菌（红色）

二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31（3）革兰氏染色实验注意事项a．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。

b．选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

c.干净的玻片、热固定、每一步水洗要彻底并且吸干等也是实验成功的关键。二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测313、复发酵实验4、结果报告

根据复发酵阳性结果证实有总大肠菌群存在的管数，查MPN检数表，即可得到总大肠菌群最可能数（MPN/100mL）。

将经过涂片、镜检证明是革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落剩余部分，再接种于乳糖蛋白胨培养液中，每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个，置37℃培养24小时，如有产酸产气者，即证实有总大肠菌群的存在。二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31（二）滤膜法（操作程序）滤膜滤器灭菌

滤膜法，又称微孔滤膜过滤法，是用滤膜将一定体积水中的总大肠菌群截留于膜片上，然后移于鉴别培养基上，养分通过膜片的毛细管供应，经37℃培养后膜片上可出现总大肠菌群的典型菌落，便于直接记数。本方法与发酵法相比优点是可以缩短阳性报告时间（48小时），具有高度重现性、使用器材少，适用于大量样品（出厂水和管网水）的检测。过滤水样滤膜培养菌落鉴别发酵证实结果报告具体操作详见GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》。操作过程中注意以下要点：二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测311、培养基与试剂

采用滤膜法测定生活饮用水及水源水中的总大肠菌群时，如果每天水样较少时，试剂可以选用市售的成品品红亚硫酸钠培养基。制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制，如质量（体积）、pH、制备条件、灭菌条件、操作步骤等，最后制成平皿放入冰箱保存。此种已制成的培养基保存不宜超过两周，如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用；如果每天水样较多，可以先制成储备培养基，高压灭菌后储存于冰箱内，检测水样时，再将储备培养基加热溶化，加入一定量的已灭菌的碱性品红和亚硫酸钠，制成平皿培养基使用。

目前我们使用的滤膜系一种硝化纤维制成的胶质膜，用4%硝化纤维乙醇丙酮溶液，在溶剂蒸发后所形成的微孔胶膜，厚0.1mm，孔径0.45μm。使用前，将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需要更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。滤器使用前灭菌，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用蒸汽灭菌器高压灭菌20分钟。2、滤膜与滤器的灭菌二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测313、滤膜培养

将一定量的水样通过装有滤膜并已灭菌的滤器，以负压抽虑干后将滤膜移于鉴别培养基上，经37℃，培养24h。需要注意的是，水样量的控制，是以滤膜上的菌落数不超过100个为宜。因此检测出厂水或清洁水的时，可以直接过滤100mL水样，如果是检测水源水、污染较严重水样或未知水样（如没有余氯）时，应加大稀释度，过滤不同稀释度的水样。

挑取滤膜上生长的具有一定特征的典型和可疑菌落作革兰氏染色实验4、菌落鉴别5、发酵证实

凡革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液，于37℃培养24小时，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。6、结果报告

计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100mL水样中的总大肠菌群数

（CFU/100mL）二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31（三）酶底物法方法介绍1、方法原理

该方法是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，同时能产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法。2、所需主要培养基及设备培养基：本方法采用MinimalMediumONPG-MUG（MMO-MUG)培养基，可选用市售商品化制品。仪器设备：定量盘（定量培养用无菌塑料盘，含51孔或97孔）、程控定量封口机（用于51孔或97孔法定量盘的封口。二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测313、定性分析a.将一个包装试剂倒入装有100mL水样的无菌取样瓶中。

b.盖上盖子摇匀。

c.在36±1℃培养24小时。

d.根据下表的说明判断定性检测结果。比阳性比色对照品的黄色浅总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阴性与阳性比色对照品的黄色相近或更深总大肠菌群为阳性与阳性比色对照品的黄色相近或更深且在紫外灯下显荧光总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阴性二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测313、定量分析a.将一个包装试剂倒入装有100mL水样的无菌取样瓶中。

b.盖上盖子摇匀。

c.将水样全部倒入51孔或97孔定量盘中，使用专用的程控定量封口机。

d.在36±1℃培养24小时。

e.根据定性结果，数出阳性格子数后对照MPN表得到定量检测结果二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31定量检测（51孔定量盘）－5步法加入试剂（MMO-MUG)后,摇晃至溶解将溶液倒入51孔定量盘中二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31定量检测（51孔定量盘）－5步法将定量盘放入程控定量封口机中在36±1℃培养24小时，然后计算呈阳性反应的格子，对照MPN表计数二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31酶底物法检测总结检测指标培养时间培养温度（℃）定性检测定量检测（100mL)总大肠菌群和大肠埃希氏菌（同时）24小时36±1℃黄色：总大肠菌群阳性黄色+荧光：大肠埃希氏菌阳性51孔：1-200MPN97孔：1-2419MPN二、微生物学指标检测方法要点总大肠菌群检测31（四）各检测方法的优缺点比较

在总大肠菌群检测方法中发酵法和滤膜法是传统的检测方法，操作步骤繁杂、干扰因素多，专一性差，要确认实验，因此检测周期较长，需48～72h，不适于大量样品的分析。但传统方法具有原理简单用较低、利于推广的优点，因此仍是常规监测中的主要检测方法。各检测方法的优缺点比较见下表。检测方法技术难易步骤确认实验检测时间准确度检测费用发酵法易繁琐需要48～72h较准确较便宜滤膜法易繁琐需要48～72h较准确较便宜酶底物法难简易不需要18～24h精确昂贵

酶底物法可以较好地弥补传统方法的不足，该法操作简便，检测时间18～24h或更短，结果可靠，需确认试验，且可以同时检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌的污染状况，能够较精确地判断水样的微生污染状况。并且此种方法已经被世界各国国家及地方实验室和世界各组织机构认可。二、微生物学指标检测方法要点耐热大肠菌群检测32二、微生物学指标检测方法要点1、耐热大肠菌群的概念

耐热大肠菌群是指在44.5℃温度下仍能生长的大肠菌群,属于总大肠菌群的一部分,而且与大肠菌群有相同的生物特性,即都能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。2、耐热大肠菌群的来源

耐热大肠菌群一般有以下4个菌属细菌组成：埃希氏菌属、产气杆菌属、枸橼酸菌属和副大肠菌属。耐热大肠菌群中的主要优势菌为埃希大肠杆菌，它只来源于粪便中的细菌。因此，通过对耐热大肠菌的检验就可以直接了解水体是否受到粪便的污染。耐热大肠菌群检测32二、微生物学指标检测方法要点3、耐热大肠菌群的检测意义4、耐热大肠菌群的限值

GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定，任意100mL水样中不得检出耐热大肠菌群。

总大肠菌群作为饮用水卫生细菌学的指标之一,是因为大肠菌群在粪便中大量存在,并且浓度低到1个/100mL

尚可检出,是粪便污染的敏感指标。然而,大肠菌群除了含有来源于粪便的细菌外,还可能含有来源于非粪便的细菌,如来源于土壤或生活污水的细菌。所以,大肠菌群的存在并不是存在粪便污染的排它性标志。也就是说,水体中有总大肠菌群只能表明水体受到了污染,但不能肯定引起污染的渠道来源于哪里。而如果检测出耐热大肠菌群，则可以揭示了水源是直接受到了粪便污染，从而标志被肠道致病菌污染的可能性较大。耐热大肠菌群检测32二、微生物学指标检测方法要点耐热大肠菌群检测32（一）多管发酵法

原理：利用大肠菌群繁殖时使乳糖发酵并能使乳糖蛋白胨培养液变黄同时产生气泡的原理。乳糖初发酵实验复发酵实验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

挑选初发酵阳性结果的发酵管（即产酸又产气），轻微振荡初发酵阳性结果的发酵管，用3mm接种环将培养物转接到EC培养液中。44.5℃下培养24小时平板分离将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，44.5℃培养18-24h，观察菌落形态。结果报告凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群为阳性查MPN表，报告结果。二、微生物学指标检测方法要点耐热大肠菌群检测32（二）滤膜法

原理：将水样注入已灭菌的放有微孔滤膜的滤器中（水样量以滤膜上长菌落20～60个为宜）

，经过抽滤。细菌即被截留在滤膜上，然后将滤膜贴于合适的培养基上进行培养，44.5℃培养24h能形成特征性菌落以此来检测水中耐热大肠菌群的方法滤膜滤器灭菌过滤水样滤膜培养菌落鉴别发酵证实结果报告

本方法与发酵法相比优点是可以缩短阳性报告时间（24小时），具有高度重现性、使用器材少，适用于大量样品（出厂水和管网水）的检测。二、微生物学指标检测方法要点耐热大肠菌群检测32（三）检测中注意的事项

通过对这项工作的开展和多次实验,我们认为在检验过程中应注意以下几点：1、进行耐热大肠菌群的检验方法有两种,一种是多管发酵法,另一种是滤膜法。根据水体受污染的情况,可采取不同的方法。这与总大肠菌群的检验方法范围是一样的。一般情况下,根据我们的水质情况，我们采取了滤膜法。这个方法简单易行,而且结果只需要24h即可得出,同时比较准确。但是，如果水样污染严重或者是水源水时，建议采取多管发酵法，如果采取滤膜法，要做好梯度稀释，以滤膜上长菌落20～60个为宜。2、滤膜法中所需要的MFC固体培养基可以用市售的成品培养基配制。配制好的培养基不要进行高压灭菌,因玫红酸若经蒸压灭菌会分解。配制好的MFC平板培养基应放在2℃～10℃的暗处保存，不应超过96h,最好现用现配，如果培养基的颜色由暗红色变成混浊的棕色就要弃去不用。3、为了保证培养箱内有一定的湿度可以把箱体内部底层放一个塘瓷盘,里边放一块湿纱布。这是防止温度高菌体干燥脱水,失去原菌体内的水分,影响其生长而采取的措施,若有条件可以用隔水式恒温培养箱或是恒温恒湿培养箱。二、微生物学指标检测方法要点大肠埃希氏菌检测33二、微生物学指标检测方法要点1、大肠埃希氏菌概念

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)通常称为大肠杆菌，属于埃希菌属。在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希氏菌，1885年由Escherich发现，革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌。大肠埃希氏菌检测33二、微生物学指标检测方法要点2、大肠埃希氏菌的来源

大肠埃希氏菌主要附生在人或动物的肠道里，为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性，可引起疾病。大肠埃希氏菌又称大肠杆菌或普通大肠杆菌，它是人和混血动物肠道中的正常寄生细菌。

作为粪便污染的最佳指示菌，大肠埃希氏菌检出的意义最大，其次是粪大肠菌群，总大肠菌群的检测意义略差一些。因此，大肠埃希氏菌是粪便污染最有意义的指示菌，已被世界上许多组织、国家和地区使用。新国标中加入大肠埃希氏菌指标，限值为100mL不得检出大肠埃希氏菌。并注明：若检出总大肠菌群，必须进行耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌检测。若水样中检出耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌，则说明水质可能受到严重污染，必须采取相应措施。

3、大肠埃希氏菌的检测意义大肠埃希氏菌检测33二、微生物学指标检测方法要点（一）多管发酵法大肠埃希氏菌检测33

大肠埃希氏菌的测定，GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定有三种方法：发酵法、滤膜法、酶底物法。一般来说，发酵法适用于饮用水、水源水尤其是浊度较高的水样，滤膜法适用于饮用水及浊度低的水源水水样。接种培养结果观察报告将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测。用烧灼灭菌的金属接种环或无菌棉签将上述试管中的液体接种到EC-MUG管中。将已接种的EC-MUG管在培养箱或恒温水浴中44.5℃±0.5℃培养24±2h将培养后的EC-MUG管在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外灯照射，如果有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌，据算阳性管数，查MPN表计数。二、微生物学指标检测方法要点（二）滤膜法大肠埃希氏菌检测33接种培养结果观察报告将总大肠菌群滤膜法有典型菌落生长的滤膜进行大肠埃希氏菌检测。在无菌操作条件下将滤膜转移到NA-MUG平板上，细菌截流面朝上，进行培养。将已接种的NA-MUG平板在培养箱或恒温水浴中36℃±1℃培养4h.将培养后的NA-MUG平板在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外灯照射，如果菌落边缘或菌落背面有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。记录有蓝色荧光产生的菌落数并报告，格式同总大肠菌群滤膜法格式。（三）酶底物法（略）具体参见总大肠菌群酶底物法二、微生物学指标检测方法要点大肠埃希氏菌检测33（三）检测中注意的事项

通过对这项工作的开展和多次实验,我们认为在检验过程中应注意以下几点：1、开展这项检验工作条件不很复杂,如果采用传统方法（发酵法和滤膜法），我们利用现有的实验室条件，不添置新的仪器设备。如果采用酶底物法，则需要添加定量盘和程控定量封口机等仪器设备。2、采用发酵法和滤膜法的培养过程有所区别。采用发酵法时，培养温度为44.5℃±0.5℃，培养时间24±2h；采用滤膜法时，培养温度为36℃±1℃，培养时间为4h。3、发酵法所需要的EC-MUG培养基（含有乳糖成分）,配制时应在366nm紫外灯光下自检无荧光后，在115℃高压灭菌20min后备用；滤膜法所需的NA-MUG（不含乳糖成分）培养基，在121℃高压灭菌15min后，倾注平板后备用。两种方法所需培养基灭菌温度时间有所不同。二、微生物学指标检测方法要点菌落总数检测34二、微生物学指标检测方法要点菌落总数检测341、菌落总数概念

水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。2、菌落总数检测意义

菌落总数按上述定义仅能表示能适应特定的培养条件而生长的菌落总的数量，而不是水中所有全部的细菌数，因为这种特定的培养条件并不能符合所有细菌生长繁殖的要求。本指标由于有特定的培养条件，因此菌落总数在评价水是否被污染时带有局限性，但是还具有相对的意义，在评价水处理的效果方面有一定的作用。二、微生物学指标检测方法要点（一）水样采集和送检1、采样瓶洗净、包扎、灭菌2、无菌采样灼烧水龙头后，放水5-10min3、中和余氯每500ml水样，预加1.5%Na2S2O32mL4、送检时间

<=2h(常温)，<=4h(冷藏)5、器材与试剂水样，无菌蒸馏水，营养琼脂培养基，1ml吸管，10ml吸管，平皿菌落总数检测34二、微生物学指标检测方法要点菌落总数检测34（二）检测步骤1、稀释水样：10ml水样加入90ml无菌蒸馏水、振荡、彻底混匀2、做1：10系列稀释三支9ml无菌蒸馏水试管3、倾注培养：1ml稀释水样、15ml培养基（45℃）4、倒置培养：37℃，24h倾注培养培养结果二、微生物学指标检测方法要点菌落总数检测34二、微生物学指标检测方法要点菌落总数检测34（二）培养及计数1、培养条件：倒置于37±1℃温箱内培养48±2h。2、计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0-4℃，但不得超过24h。3、菌落计数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀释度的各平板平均菌落数。4、计算方法某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值，应选择菌落数在30-300之间的稀释度（1）仅有一个稀释度在此范围：菌落数×稀释倍数。（2）有两个稀释度在30-300之间：菌落数之比>2，选较小值；菌落数之比<2，取平均值。（3）所有稀释度均>300，则取稀释倍数最大者乘以稀释倍数报告。（4）所有稀释度均<30，则取稀释倍数最小者乘以稀释倍数报告。（5）没有任何稀释度在30-300之间，则选最接近该范围者（30或300）乘以稀释倍数报告。5、结果单位：CFU/mL。二、微生物学指标检测方法要点菌落总数检测34（三）注意事项1.无菌操作

2.做好标记

3.何时更换吸管

4.吸吹混匀

5.琼脂培养基保温

6.安全常识二、微生物学指标检测方法要点“两虫”检测35二、微生物学指标检测方法要点二、微生物学指标检测方法要点“两虫”1.什么是“两虫”？贾第鞭毛虫隐孢子虫（Giardia）(Cryptosporidium)二、微生物学指标检测方法要点2.贾第鞭毛虫的结构特征贾第鞭毛虫以孢囊(Cyst)的形态存在于水中,大小约8～12μm，单细胞的寄生虫。荧光显微镜DIC显微镜二、微生物学指标检测方法要点2.贾第鞭毛虫的结构特征Giemsa

染色DIC显微镜二、微生物学指标检测方法要点隐孢子虫以卵囊(Oocyst)的形式存在于水中,大小为4～6μm.单细胞的寄生虫.3.隐孢子虫的结构特征荧光显微镜DIC显微镜二、微生物学指标检测方法要点4.“两虫”的分布隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊可在水环境如地表水、地下水、泉水、饮用水(包括只经消毒、直接过滤或常规处理的饮用水)中均可发现.而在有农田排水的水域、有动物粪便排入的地表水中,以及污水处理厂排出的水中可能会有较多的卵囊.二、微生物学指标检测方法要点5.“两虫”的危害贾第鞭毛虫致病剂量为10～100个活孢囊,隐孢子虫致病剂量仅为1～10个活卵囊.贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊污染饮用水源引起疾病的普遍症状是腹泻、呕吐、腹痛、低烧等.贾第鞭毛虫每年感染人数约为2.5亿,隐孢子虫每年感染人数约有2.5～5亿,对免疫功能正常的人来说,症状一般为自限性的,几乎不导致死亡.但对于免疫功能缺陷者会危及生命,目前尚无特效治疗.二、微生物学指标检测方法要点6.“两虫”的相关水质标准我国的《城市供水水质标准》(CJ/T206—2005)和《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)都在水质非常规指标中规定了贾第鞭毛虫和隐