免疫原和抗体的制备

免疫原和抗体的制备第一页，共五十四页，2022年，8月28日概要第一代抗体：多克隆抗体第二代抗体：单克隆抗体第三代抗体：基因工程抗体第二页，共五十四页，2022年，8月28日第一部分多克隆抗体制备英文全称：polyclonalantibody,PcAb定义：它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的抗体，是多种抗体的混合物。如何制备？是通过给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清。第三页，共五十四页，2022年，8月28日人体BBBBAgAgAgAg免疫血清制备机制人体第四页，共五十四页，2022年，8月28日免疫原(及佐剂)的制备免疫动物试血抗血清的保存抗血清的鉴定采血收集血清抗血清的纯化第五页，共五十四页，2022年，8月28日一、免疫原的制备免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质一)颗粒性抗原的制备二)可溶性抗原制备及鉴定三)半抗原免疫原的制备第六页，共五十四页，2022年，8月28日细胞抗原：绵羊红细胞细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原寄生虫体抗原：虫卵一）颗粒性抗原的制备特点：制作方法较为简单；悬液呈浑浊状或乳浊状；免疫时多用静脉注射，不需佐剂第七页，共五十四页，2022年，8月28日

绵羊红细胞的制备流程图摇动15-20min

4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%第八页，共五十四页，2022年，8月28日

细菌菌体抗原的制备流程图液体培养或斜面培养37℃24h100℃水浴2～2.5h

杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原第九页，共五十四页，2022年，8月28日来源:

组织、细胞或血液，其成分较复杂。

二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸二）可溶性抗原制备及鉴定第十页，共五十四页，2022年，8月28日制备流程：细胞的破碎抗原的分离及纯化器官组织：组织细胞：血液：抗原的鉴定组织碎块预处理返回第十一页，共五十四页，2022年，8月28日1、组织材料的预处理组织必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5g／LNaN3冷浴中组织剪碎组织碎块第十二页，共五十四页，2022年，8月28日1)高速捣碎法2)研磨法3)超声破碎法4)反复冻融法5)酶处理法6)表面活性剂处理2、细胞破碎技术及评价物理法化学法第十三页，共五十四页，2022年，8月28日上清液澄清组织碎块装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液2000r／min取上清液去除细胞碎片及微小组织离心特点：①操作简单，无需贵重仪器；②多用于内脏组织的破碎。1)高速捣碎法1000r／min15000r／min第十四页，共五十四页，2022年，8月28日原理：利用超声波的机械振动产生的压力足以使细胞破碎。方法：使用的频率从1kHz～20kHz不等的超声波处理细胞，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。2)超声破碎法特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于组织细胞和细菌的破碎。第十五页，共五十四页，2022年，8月28日

2.冻融法原理：因速冻缓融，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度突然改变而破坏细胞。3)反复冻融法方法：将待破碎的细胞置-20℃冰箱内冻结，然后室温融化，如此反复3-4次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。第十六页，共五十四页，2022年，8月28日

常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等

1.酶处理法4)酶处理法方法：在一定的条件下，能消化细菌和组织细胞。

特点：①此法适用多种微生物；②具有作用条件温和；③内含物成分不易受到破坏；④细胞壁损坏的程度可以控制。第十七页，共五十四页，2022年，8月28日原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。5)表面活性剂处理常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。应用：①破碎细菌，且作用比较温和；②提取核酸时，常用此法破碎细胞。返回第十八页，共五十四页，2022年，8月28日3、蛋白质抗原的提取与纯化蛋白质亲和层析离子交换层析凝胶过滤盐析沉淀超速离心分离法蛋白质、多糖、脂类、核酸第十九页，共五十四页，2022年，8月28日

1)．超速离心法

原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。

1)超速离心法特点：用差速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极难将某一抗原成分分离出来。

应用：用于少部分大分子抗原IgM、C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。不适于中、小分子量蛋白质。转速大于20000r/min第二十页，共五十四页，2022年，8月28日2)盐析法方法：用50、33%的硫酸铵分次提取，即可获得丙种球蛋白(含IgG95%以上)。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。原理：白蛋白可溶于半饱和的硫酸铵溶液中，而球蛋白则沉淀析出；该达到饱和时，白蛋白也析出，因此不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠，可将白蛋白和球蛋白分离。第二十一页，共五十四页，2022年，8月28日

3．凝胶层析法（凝胶过滤法）原理：利用凝胶的多孔网状结构，大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、中、小三种。属区带分离法。3)凝胶层析法（凝胶过滤法）特点：是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。

第二十二页，共五十四页，2022年，8月28日

原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。4)离子交换层析法第二十三页，共五十四页，2022年，8月28日5)亲和层析法（蛋白A纯化IgG）蛋白A琼脂糖上样静置30分钟注：上样速度慢第二十四页，共五十四页，2022年，8月28日优点：纯度高、获得物不失活性，简便快捷。返回结合缓冲液冲洗洗脱缓冲液冲洗第二十五页，共五十四页，2022年，8月28日纯化抗原的鉴定1).含量鉴定

2).理化性质鉴定①凝胶层析技术测定

②聚丙烯酰胺凝胶电泳

③凝胶管状电泳

④超速离心3).纯度鉴定

常用醋酸纤维膜电泳

4).免疫活性鉴定

常用双向琼脂扩散试验4、纯化抗原的鉴定返回第二十六页，共五十四页，2022年，8月28日

四、佐剂英文全称：immunoadjuvant概念：

与抗原同时或预先注射于机体，能增加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。

二、免疫佐剂第二十七页，共五十四页，2022年，8月28日化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸∶胞苷酸(polyI∶C)、脂质体生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白一)佐剂的种类第二十八页，共五十四页，2022年，8月28日用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、polyI∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)

一)佐剂的种类第二十九页，共五十四页，2022年，8月28日1.氢氧化铝佐剂：5%硫酸铝5%氢氧化钠氢氧化铝沉淀制成悬液即为佐剂强烈搅拌NS洗二次NS等体积抗原免疫接种（二）常见佐剂第三十页，共五十四页，2022年，8月28日2.明矾佐剂10%硫酸钾铝氢氧化钠校正pH值至6.5沉淀乳状悬液*明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射易引起肉芽种和脓肿。NS搅拌NS洗二次离心抗原备用防腐剂第三十一页，共五十四页，2022年，8月28日混合1~5:1作用大于不完全佐剂;局部形成肉芽种和溃疡;不能用于人体弗氏完全佐剂3.弗氏佐剂(Freundadjuvant)液体石蜡＋弗氏不完全佐剂卡介苗终浓度2～20mg/ml羊毛脂抗原抗原1:11:1完全乳化鉴定一滴乳剂乳剂不散浮于液面水中第三十二页，共五十四页，2022年，8月28日乳化方式：研磨法：

易乳化，但抗原或佐剂用量大。搅拌混合法：

无菌操作，节省抗原或佐剂，但不易乳化完全。第三十三页，共五十四页，2022年，8月28日4.脂质体其与抗原合用，可更有效地激发机体的免疫功能，增强免疫反应。IL－2、IL－1、IFN等都是良好的佐剂。包封抗原后，可使抗原延缓释放，并且脂质体有刺激机体免疫反应的作用。5.细胞因子第三十四页，共五十四页，2022年，8月28日1.改变抗原的物理性状，使抗原在体内滞留或延缓释放，延长抗原与免疫细胞作用的时间，从而增强抗原免疫原性。2.抗原在佐剂的辅助作用下，更易被巨噬细胞有效吞噬和有效的加工处理和呈递。3.刺激单核－巨噬细胞活化，释放细胞因子调节和增强淋巴细胞的应答能力。4.刺激淋巴细胞增生分化，从而增强和扩大免疫应答能力。（三）作用机制第三十五页，共五十四页，2022年，8月28日应用佐剂的缺点①佐剂常混有微量其它物质，这些物质进入体内后也可引起抗体的产主，影响抗血清的特异性；（四）应用佐剂的缺点②注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌性脓肿；③反复注射，易发生超敏反应，使局部组织坏死，甚至引起动物死亡。第三十六页，共五十四页，2022年，8月28日

三、免疫动物一）、动物的选择

1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；2.动物个体选择:

适龄、健壮、无感染正常动物、体重合乎要求；3.抗原性质:酶类—豚鼠；甾体激素—家兔

4.血清用途:

R型:等价带宽,适于诊断试剂.用家兔免疫产生.

H型:等价带窄,适于免疫治疗.用马免疫产生.5.抗血清需要量选择:第三十七页，共五十四页，2022年，8月28日

三、免疫动物二）、免疫方法

1.免疫剂量：1)不能过大或过小，否则产生免疫耐受；2)首次免疫剂量不宜过大3)大:0.5-1mg/只小只2.免疫途径：3.免疫间隔时间：

第三十八页，共五十四页，2022年，8月28日2.免疫途径1）.皮内或皮下注射：

a.采用多点注射(8-10点)；

b.半抗原宜皮内多点注射；

c.皮内注射易引起细胞反应，对提高抗体效价有利，但皮内注射较困难(因佐剂加入后粘度大)。2）.腹腔和静脉注射:

多用于颗粒性抗原和加强免疫。3）.淋巴结内注射:

适宜于微量抗原(先用完全佐剂在足掌作基础免疫)。第三十九页，共五十四页，2022年，8月28日3.免疫时间第二次第三次第一次第四次1）.间隔约10-20天（宜长、否则导致免疫耐受）；2）二次以后每次间隔7~10天（过长→刺激变弱→抗体效价不高。）第四十页，共五十四页，2022年，8月28日3)一般接种5-8次4)半抗原的免疫间隔要求较长(30~40天)。如8次免疫后仍不产生抗体，则应更换动物。第四十一页，共五十四页，2022年，8月28日四、试血效价测定

采血(末次免疫5-7天及时采血)

补充免疫效价不合格

效价合格

免疫3-5次第四十二页，共五十四页，2022年，8月28日五、采血颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊

心脏采血法：

家兔、豚鼠、大鼠、鸡

静脉采血法：

家兔、山羊、绵羊

第四十三页，共五十四页，2022年，8月28日六、免疫血清的纯化免疫血清是成分复杂的混合物，除有特异性和非特异性抗体，还有各种蛋白成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体及蛋白干扰试验结果。第四十四页，共五十四页，2022年，8月28日抗血清IgG类抗体（不纯）硫酸铵盐析多次（粗提）特异性IgG抗体凝胶过滤离子交换层析亲和层析吸附法亲和层析第四十五页，共五十四页，2022年，8月28日1.效价的鉴定：即为抗体含量的测定

根据抗原性质不同，可采取不同抗体效价测定方法。颗粒性抗原可采用凝集试验。可溶性抗原常用免疫双扩散法。2.抗体的纯度鉴定：SDS－PAGE。

若只出现一条蛋白电泳区带说明抗体纯化已达到要求，而出现多条蛋白区带则表明抗血清中混有杂蛋白，必须进一步纯化。七、抗体的鉴定第四十六页，共五十四页，2022年，8月28日3.特异性鉴定：抗体对相应或相似抗原识别能力

一般用特异性抗原及其相似的抗原与待鉴定抗体进行免疫双扩散试验。如果出现交叉反应，说明有杂抗体存在。可应用相应抗原吸收杂抗体，即可得到单价特异性抗体。4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好亲和力测定主要有平衡透析法、酶联免疫法和放射分析法。亲和力的高低是由抗原分子和抗体分子的结合位点、抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。七、抗体的鉴定第四十七页，共五十四页，2022年，8月28日八、免疫血清的保存1.4℃保存：可保存3～6个月2.低温保存：-20～-40℃，可保存2～3年抗体的保存浓度为20～30mg/ml为宜，加入1/10000的硫柳汞或1/1000的叠氮钠防腐，并加入等体积的中性甘油，分装小瓶，置-20℃以下低温保存。3.冰冻干燥保存：可保存5～10年第四十八页，共五十四页，2022年，8月28日举例：抗人白蛋白的制备1、抗原的准备：分别抽取数人全血，分离血清并混匀；分离制备白蛋白(请问可用哪些方法？)2、佐剂的准备：

福氏不完全佐剂：称取羊毛脂5g，逐滴加入石蜡油20ml高压灭菌后4℃保存备用。

福氏完全佐剂：于不完全佐剂中加入2~20mg/ml卡介苗，研钵中钵磨乳化后即成为完全佐剂，冰箱保存备用。第四十九页，共五十四页，2022年，8月28日3、抗原-福氏完全佐剂的制备：

取混合人全血清，用生理盐水作1：4稀释。将稀释血清与完全佐剂1：1体积的比例混