基因操作原理display基因展示技术

以微生物细胞表面展示为主线的基因操作原理2004年4月22日星期四通常是指通过遗传操作将外源大分子定位表达在微生物细胞表面以便直接利用全细胞进行后续工作而无须基因产物的提取、纯化、和重新折叠等操作一、微生物细胞表面展示

Microbialcellsurfacedisplay,MCSD微生物细胞表面展示第一部分MCSD主要以构建融合蛋白方式来实现即将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合借助后者的表面识别和表面定位功能将前者携带并定位在细胞表面前者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白即将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合借助后者的表面识别和表面定位功能将前者携带并定位在细胞表面前者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白宿主菌细菌和酵母菌展示了病原菌的抗原表位、多聚组氨酸肽、蛋白质文库、金属硫蛋白、多种酶类、多种单链抗体和T细胞受体的信号分子运载蛋白膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素、以及S-层蛋白等宿主菌细菌和酵母菌展示了病原菌的抗原表位、多聚组氨酸肽、蛋白质文库、金属硫蛋白、多种酶类、多种单链抗体和T细胞受体的信号分子运载蛋白膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素、以及S-层蛋白等二、微生物细胞表面展示技术的应用MCSD技术广泛应用于生物工程领域，可开发和利用来进行蛋白构象的分析、活菌疫苗的研制、临床诊断、表面抗原的直接克隆、以及抗体工程应用等。1.构建和筛选蛋白质文库2.开发活菌体疫苗，制备抗血清和多克隆抗体3.构建全细胞催化剂4．开发新型微生物吸附剂5．研制新型生物传感器三、举例DisplayofPoly-HisPeptidesonEscherichiacoliCellSurface在大肠杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽SchematicPresentationofE.coliOmpC

LQ位点含PstI位点GATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGGCTATCTATGGACGTCCAGCTGGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAAGACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACCPoly(His)6XhoIPstIPstISalILQVDPSGSGLEDILQGATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGGCTATCTATGGACGTCCAGCTGGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAAGACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACCGTCGACCAGCTGCTCGAGGAGCTCGTCGAGCAGCTCCTCGACGAGCTGSalIXhoIXhoIPstIPstISalISequenceInsertedintoOmpCL7ExpressionofOmpC-(6His)nat30CFractionofOmpCoritsderivatesofthetotaloutermembraneproteins123456ExpressionofOmpC-(6His)nat25CFractionofOmpCoritsderivatesofthetotaloutermembraneproteins12InteractionBetweenNeighboringHistidinesandNi-NTAAgaroseEachNi2+requiresixpairsofelectronstoformastablecoordinationspherearound;fourofthemareavailablefromNTA,andtwooftheothertwoareexpectedfromneighboringhistidines.NTA:nitrilotriaceticacid次氮基三乙酸Ni-NTA-AgaroseSurfaceboundcellsof(a)MC4100(pTCHP2)and(b)MC4100(pTCHP3)AttachmenttoNi-NTA-Agarosebeads碘化丙锭

染色细胞,543nm氦/氖激光，

570nm光栅

AttachmenttoNi-NTA-AgarosebeadspTCdPpTCHP1pTCHP2pTCHP12pTCHP6pTCHP3AllrecombinantcellscouldattachtothesurfaceofNi-NTA-AgarosePoly-Hispeptideswereexposedsuccessfullybeads,exceptMC4100(pTCHP18)Cd2+AdsorptionofMC4100(pTCHPn)TheadsorptioncapacityincreasedalongwiththeincreasingMC4100(pTCHPn)canbeusedasbioadsorbents.numberof6Hisunits.三、S-层蛋白用于表面展示细菌表面S-层

细胞膜细胞壁S-层CellsurfacelayerS-layer第二部分

细菌细胞表面S层简介一、S-layer的分布广泛存在于许多古细菌和真细菌的细胞最外表面在绝大多数古细菌当中，S层是细胞唯一的外壁层在所有的主干细菌类群中的几百个种中都检测到对于发现S-层的某个种来说，并不是每一个分离株都存在S-层尽管S-layer分布广泛，但其存在在相当长一段时间内并没有引起人们的重视因为

S-layer在实验室培养过程中容易丢失，Freeze-etchingelectronmicroscopy能观察到S-层可在细胞生长的所有阶段完全覆盖在细胞表面二、S-层的结构和组成由蛋白质或糖蛋白构成的单分子晶格状的聚合层由蛋白质或糖蛋白构成40kDa-200kDa50nmG-古细菌G+细菌G-真细菌a.嗜酸热硫化叶菌Sulfolobusacidocaldarius(古细菌);b.杀鲑气单胞菌(G-);c.苏云金芽胞杆菌(G+)。PM,质膜;PG,肽聚糖层；OM,外膜；CW,细胞壁；S,S-层。内标50nm。完整细胞表面覆盖5105

单体

500copies单肽/秒

合成，转运至细胞表面，组装成晶格结构

Generationtime:20-30minS-层蛋白的启动子是非常强的Lactobacillusacidophilus(嗜酸乳酸杆菌)S-层蛋白的启动子乳酸脱氢酶基因启动子的两倍

(是细菌中最强启动子之一)炭疽芽胞杆菌Sap蛋白由814aa组成含N-末端29aa信号肽，其SLH位于N-末端200aa以内，通过该SLH已使聚蔗糖果聚糖酶成功地在细胞表面得到表达其表达的分子数与细胞表面S-层中S-层蛋白的分子数相当四、S-层的应用前景人们对S-层的应用潜力寄予厚望在生物技术和仿生学方面

1.S-层可开发成超滤膜分子筛2.S-层在开发疫苗方面具广阔前景与特异性抗原或半抗原结合可作为佐剂系统加以使用3.提高脂膜的稳定性通过S-层蛋白在脂膜上重结晶成S-层，可明显提高脂膜的稳定性，便于研究膜蛋白的生物学功能4.S-层在纳米材料方面有巨大应用潜力S-层可作为形成有序排列的纳米金属或半导体材料的模板;这些具有特殊物理性质的材料可广泛用于纳米电子学和非线性光学的研究5.细胞表面展示CellsurfacedisplayS-层是一个极有前途的、可用于细胞表面定位表达蛋白质的展示系统S-层蛋白表达量高，可达细胞蛋白的15%，而且可有效地与细胞壁结合第三部分

利用S-层蛋白进行表面展示的基因操作一、S-层蛋白的基因克隆

苏云金芽胞杆菌

，具杀虫活性苏云金芽胞杆菌一种细菌广泛存在于土壤等自然环境简称

苏云金杆菌

或

BtBacillusthuringiensis伴胞晶体(kDa)20011697.466453121.5SDSprofileofcrystalproteinofBacillusthuringiensisCTCandT02strainMCTCT02M苏云金芽胞杆菌

CTC测定

CTC蛋白

(~100kDa)第一次：AGKSFPDVPADHWGI第二次：AGKSFPDV(P)A

PrimerdesignCTC-46

GCAGGAAAATCATTCCCAGACGTTCDigestedCTCDNAwithvariousrestrictionenzymesSouthernhybridizationtoCTCDNA(DIG-labeling)KbladderRestrictlocationofctcgene9.0kbHpaII9.5kbEcoRI以9.0kbHpaII和9.5kbEcoRI为目标构建文库E.coilX-Blue(pBMB982)

重组E.coil

生长艰难

易于自溶构建亚基因组文库以基因组中某些DNA片段为目标所构建的DNA文库但在以9.0kbHpaII和9.5kbEcoRI为目标构建的文库中，得不到阳性克隆子表达S-layer蛋白的E.coli3.1kbClaI2.9kbXbaIX2814082bpEcoRI-ClaIpBMB982第一个来自苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白基因(Saraetal,J.Bacteriol,2000)DNASequencing

EcoRI/ClaIfragmentThe4082bpsequenced

816aaencodingcapability

GenBankAJ012290

3141ATTAAAGAAGTAAAAGAAGTAAAATAATAATTATTAAAGCIKEVKEVK--

3181CTATGAGAAAATAGACAAAAGTCTATGAGTATCATAGGCT

3221TTTTATTTTGATCTTATTTCATATATATTTTAGATTGAAG

X2814082bpEcoRI-ClaIpBMB982Cloningofctc-2geneClaI:3.1kb2.9kbClaI2.9kbinpKSClaIClaIClaIctc-2genectc-1geneFulllengthctc-2gene?Problem1ClaI--ctc-2gene(2.9kb)cannotberecoveredATCGATCGTGCTTCTGCAGCTGTAATCTTCACClaIDammethylationsiteClaIissensitivetomethylationGM2163:dam-dcm-VJS987:dam-Purifyplasmidfromdam-E.coliClaIClaIClaIctc-2genectc-1geneProblem2ctc-1genecannotberecoveredatits3-end实际使用pIJ2925ATCGATTAGCTAGTCGACCAGCTGClaIAccIATCGACTAGCTGligationATCGACCGGCATGCAAGCTTTAGCTGGCCGTACGTTCGAASphIHindIIISphIATCGACCGGCATGCAAGCTTTAGCTGGCCGTACGTTCGAAKlenow/dATPATCGACAAGCTTTAGCTGGCCAAMungBeanNucleaseATCGACAAGCTTTAGCTGGCCAAMungBeanNucleaseATCGATTTAGCTAAligationATCGATTTAGCTAARecoveringClaI8611/ClaIK23/ClaI二、表达载体

稳定

安全

高效表达（一）质粒复制区的克隆利用Bt内源质粒的复制片段作为载体稳定因素任何一个质粒都含有一段与复制有关的区域，包括1.复制起点and/or2.复制蛋白／复制起始蛋白基因and/or3.其他任何一个质粒的复制有宿主特异性如在Gram+/Gram-有差异Gram+

细菌质粒复制区克隆载体Ori/E.coliAmp抗性基因

(E.coliorGram－)Sp壮观霉素抗性基因

(Gram＋)1.ori9741GenBankAF202532

2.ori2062GenBankAF050161cry3AapBMB608pBMB685稳定性为

99.5%无抗生素选择压力40代stabilitytest以内源质粒为基础的质粒载体在无选择压力的情况下，能够稳定遗传（二）解离载体的构建RestnpItnpATn4430转座子通过体内重组可去掉非BtDNA片段解决环境释放安全问题crygeneoriBtresresermamporiEccrygeneoriBtresresermamporiEc受体菌中发生解离TnpI只能在苏云金芽胞杆菌中复制

只能在大肠杆菌中复制

解离载体的解离IRSIRS解离载体pBMB801的构建及解离resolutionori/tsTcori/EAmptnpItnpA2.整合在染色体

转座子整合载体三、S-层蛋白用于表面展示的前景信号肽SLH锚定序列1．六聚组氨酸肽Poly(His)6

Poly(His)6)对重金属二价阳离子如镉(Cd2+)、镍(Ni2+)、铜(Cu2+)、锌(Zn2+)和铅(Pb2+)等具有螯合(吸附)作用,可用于重金属污水处理目前几乎所有的表达重金属结合能力的细菌都限定在大肠杆菌成功的重组菌在固定化之后在重金属污水处理方面，以及重金属矿物富集方面将有重要的应用潜力金属硫蛋白具有相似作用ctc-(6His)n融合基因的构建6HisPCR产物电泳图1231，100bpLadder；2，3，6HisPCR产物PvuIIPCRXbaIPvuII

EcoRIXbaIHincIISphIEcoRIXbaISphIEcoRIKpnIBamHIXbaISalISphIslhXbaI(6His)slh(6His)1slh(6His)1pBMB-982pHT304重组质粒pBMB-SHA1构建示意图pBMB-SHA1重组质粒pBMB-SHB1构建示意图XbaI(6His)XbaIPCRXbaIXbaIXbaIpBMB982-304slh(6His)1pBMB-SHB1slh(6His)1EcoRISalIXhoIslh(6His)1EcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRI+SalIEcoRISalIXhoIEcoRI+XhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)2融合基因的构建slh(6His)2EcoRISalIXhoIslh(6His)1EcoRISalIXhoIEcoRI+XhoIEcoRI+SalIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)3融合基因的构建EcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)1ctc-(6His)2ctc-(6His)3ctc-(6His)6ctc-(6His)9ctc-(6His)15ctc-(6His)12ctc-(6His)18ctc-(6His)n融合基因构建示意图12345678重组质粒pBMB-SHAn酶切验证电泳图1，λ/HindIII分子量标准2，pBMB-SHA18/ClaI+XhoI3，pBMB-SHA12/ClaI+XhoI4，pBMB-SHA6/ClaI+XhoI5，pBMB-SHA3/ClaI+XhoI6，pBMB-SHA2/ClaI+XhoI7，pBMB-SHA1/ClaI+XhoI8，100bpLadder重组质粒pBMB-SHBn酶切验证电泳图12345671，λ/HindIII分子量标准；2，pBMB-SHB15/ClaI+XhoI；3，pBMB-SHB9/ClaI+XhoI；4，pBMB-SHB3/ClaI+XhoI；5，pBMB-SHB2/ClaI+XhoI；6，pBMB-SHB1/ClaI+XhoI7，

100bpLadder携带ctc-(6His)n融合基因重组菌的构建将pBMB-SHAn系列重组质粒转入受体菌171/pBMB-CSA中将pBMB-SHBn系列重组质粒转入受体菌4Q7/pBMB-CSASDS检测融合蛋白的表达1234567812345678重组质粒pBMB-SHAn在171中表达的SDS1，分子量标记；2，171/pBMB-CSA；3，171/pBMB-SHA1；4，171/pBMB-SHA2；5，171/pBMB-SHA3；6，171/pBMB-SHA6；7，171/pBMB-SHA12；8，171/pBMB-SHA181234567重组质粒pBMB-SHBn在4Q7中表达的SDS12345671，4Q7/pBMB-CSA；2，4Q7/pBMB-SHB15；3，4Q7/pBMB-SHB9；

4，4Q7/pBMB-SHB3；5，4Q7/pBMB-SHB2；6，4Q7/pBMB-SHB1；7，分子量标记。CTC-(6His)n融合蛋白活性的检测CTC-（6His）n融合蛋白对镍离子的吸附CTC-（6His）n融合蛋白对镉离子的吸附CTC-（6His）n融合蛋白对镍离子的吸附检测表达了CTC-（6His）n融合蛋白的重组菌与Ni-NTA-Agarose吸附作用用碘化丙锭对细胞染色荧光显微镜观察使用波长为532nmInteractionBetweenNeighboringHistidinesandNi-NTAAgarose

含质粒pBMB-SHAn的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的吸附作用A,171/pBMB-CSA；

B，171/pBMB-SHA1；

C，171/pBMB-SHA2；D，171/pBMB-SHA3；

E，171/pBMB-SHA6；

F，171/pBMB-SHA12；G，171/pBMB-SHA18ABCDEFG含质粒pBMB-SHBn的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的吸附作用A，4Q7/pBMB-CSA；

B，4Q7/pBMB-SHB1；

C，4Q7/pBMB-SHB2；D，4Q7/pBMB-SHB3；

E，4Q7/pBMB-SHB9；

F，4Q7/pBMB-SHB15ABCDEFCTC-（6His）n融合蛋白对镉离子的吸附定量测定采用全谱直读等离子体发射光谱仪测定使用波长为228.802nm12345674107310721071107重组菌171/pBMB-SHAn和4Q7/pBMB-SHBn对Cd2+的吸附作用系列1：1，171/pBMB-CSA；

2，171/pBMB-SHA1；3，171/pBMB-SHA2；

4，171/pBMB-SHA3；5，171/pBMB-SHA6；6，171/pBMB-SHA12；

7，171/pBMB-SHA18系列2：1，4Q7/pBMB-CSA；

2，4Q7/pBMB-SHB1；3，4Q7/pBMB-SHB2；

4，4Q7/pBMB-SHB3；5，4Q7/pBMB-SHB9；6，4Q7/pBMB-SHB152.Aii抗病蛋白在细胞表面的展示但该蛋白为胞内蛋白，若在细胞表面表达可增强其抗病作用ctc-aii融合基因

的构建

CGGCTCTAGACATGACCGTAAAGAAGCTTTAaii-up:aii-down:AGCTGCATGCCTATGTATACTCCGGGAACAXbaISphI以pGEMT-4Q7aii为模板aii基因及pBMB-SAII重组质粒PCR扩增产物电泳图

1231，100bpsLadder；2，aii基因PCR产物；3，pBMB-SAII重组质粒PCR扩增产物XbaISphIslhpGEMT-4Q7aiiXbaISphIaiipBMB982-304XbaI+SphIslhaiipBMB-SAII重组质粒pBMB-SAII的构建示意图pBMB-SAII质粒图谱重组质粒pBMB-SAII的酶切验证电泳图12341，pBMB-SAII/HindIII；2，pBMB-SAII/SphI；3，pBMB-SAII/XbaI；4，λ/HindIII