几种酶的测定方法

各种酶的测定方法:土壤脲酶测定方法（靛酚比色法）根据脉酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。试剂配制：甲苯（分析纯）10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中。（当天做当天配）柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2升。苯酚钠溶液：A.62.5克苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。B.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。将二溶液保存在冰箱里。使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。标准溶液：称0.4717克硫酸铵（105°C烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。分别吸取0、0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加入试剂，最后定容至50毫升使溶液浓度为：0、0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。分析步骤：称2~5克过20目风十土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好，15分钟后加10毫升10%尿素和20毫升pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后，在30C恒温箱中培养24小时，过滤。取滤液1~3毫升（视样品浓度定）于50毫升刻度试管中，加入4毫升苯酚钠溶液和3毫升次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20分钟后定容，在分光光度计波长578nm处比色（1cm比色杯）。反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。还需减去无土基质（尿素+柠檬酸盐）。结果计算：月尿酶活性以24小时内每克土中氨态氮的毫克数来表示。NH3-N（mg/1g土24h）=（浓度X稀释倍数X比色体积）：（1000X十土重）1000为ug换算成mg土壤磷酸酶的测定（磷酸苯二钠测定法）本法测定是以磷酸苯二钠为基质，在磷酸酶的作用下，用水解基质所生成的苯酚的量来表示酶的活性。试剂配制:甲苯（CR）①pH5醋酸盐缓冲液：（酸性土壤）A：0.2N醋酸溶液：称取1.776克冰醋酸和9.58克醋酸钠溶解，加蒸馏水定容到1000毫升。B：0.2N氢氧化氨溶液：取含25%〜28%的氨水14.02毫升稀释至500毫升。取A、B溶液各250毫升用蒸馏水定容至1000毫升。pH7柠檬酸盐缓冲液：（中性土壤）A：0.1M柠檬酸溶液：称21.01克柠檬酸溶于1000毫升蒸馏水中。B：0.2M磷酸氢二钠溶液：Na2HPO4*7H2O53.63克或Na2HPO4*12H2O71.7克稀释至1000毫升。取A溶液64毫升，B溶液436毫升稀释至1000毫升。pH10硼酸盐缓冲液：（碱性土壤）A：0.05M硼砂溶液（Na2B4O710・H2O）称取19.05克硼砂溶于1000毫升蒸馏水中。B：0.2M氢氧化钠：8克氢氧化钠溶于1000毫升蒸馏水中。取A溶液50毫升，B溶液43毫升，加水稀释至200毫升。pH9.8氨性氯化氨溶液：称取20克氯化氨溶于100毫升浓氨水中，储存在橡皮塞瓶中，保存于冰箱。0.5%磷酸苯二钠（Na2C6H5PO4・2H2O）：称5克磷酸苯二钠溶于1000毫升缓冲液。2%4-氨基安替匹林：称取2克4-氨基安替匹林，先用少量水溶解，最后稀释至100毫升，浑浊时用滤纸过滤后使用。（一周内有效）8%铁氤化钾溶液：称8克铁氤化钾溶于少量水，定容至100毫升，储存在棕色瓶中。（一周内有效）酚的标准溶液：原液配制：0.5克重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至500毫升，储存于棕色瓶中，浓度即为1000ppm。工作液配制：取2.5毫升原液稀释至250毫升，即浓度为10ppm，储存于棕色瓶中。分别取工作液0、1、3、5、7、9、11、13、15毫升于50毫升容量瓶或50毫升比色管中，50毫升溶液的浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0ppm试剂与测定相同。分析步骤：称过20目的风干土2克于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好瓶塞，15分钟后加0.5%磷酸苯二钠溶液20毫升（对照直接加20毫升缓冲液），摇匀并置37°C恒温培养24小时，培养结束后立即过滤。吸滤液1~5毫升于50毫升容量瓶（或比色管）中，加入0.25毫升氨性氯化氨，0.5毫升2%4-氨基安替匹林和0.5毫升8%铁氤化钾溶液，边加边摇匀，15分钟后定容，在波长510毫微米处比色。（用1厘米比色杯，显色后1.5小时内稳定）每一土样设置用水代替基质的对照，还需减去无土基质。结果计算：磷酸酶活性以24小时1克土酚的毫克数表示酚（mg/1g土,24h）=（土样浓度X分取倍数X比色体积）：（1000X十土重）1000：ug换算成mg（蔗糖酶）土壤转化酶测定方法原理：转化酶水解蔗糖生成了葡萄糖和果糖，葡萄糖将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，用比色法测得葡萄糖生成量，以此来表示酶的活性。试剂：3,5-二硝基水杨酸溶液：0.5克3,5-二硝基水杨酸溶于20毫升2NNaOH溶液和50毫升水中，加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100毫升，倒入棕色瓶中，并放入冰箱中保存。8%蔗糖溶液：分析纯蔗糖8克溶于100毫升蒸馏水中。甲苯磷酸缓冲液：（1）称取23.88克分析纯磷酸氢二钠（Na2HPO4・12H2O）溶于少量水中，定容至1升，即为1/15克分子浓度溶液。（2）称取9.072克分析纯磷酸二氢钾溶于少量水中，定容至1升，即为1/15克分子浓度溶液。（3）分别从（1）中吸取600毫升（2）中吸取400毫升混合即为pH7.0磷酸缓冲液。（土壤理化分析P544）标准溶液：从1000ppm标准葡萄糖溶液中分别吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0毫升溶液放入25毫升比色管中即得0、20ppm、40ppm、80ppm、120ppm、160ppm、200ppm、240ppm、320ppm、400ppm标准系列溶液。与土样同法做。测定步骤：取2.00克过20目筛的风干土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，15分钟后加入8%的蔗糖溶液15毫升，加磷酸缓冲液5毫升，于37^保温箱中培养24小时后过滤。取1~2毫升滤液于25毫升比色管中，加3毫升3，5-二硝基水杨酸溶液，在沸水浴中煮沸5分钟，然后立即放入冷水中冷却，在分光光度计550毫微米处比色。同时做无基质土壤（甲苯+蒸馏水15毫升+磷酸缓冲液5毫升）和无土基质土壤即试剂空白（甲苯+蔗糖溶液15毫升+磷酸缓冲液5毫升）为对照进行比较。结果计算：葡萄糖（mg/g十土•24h）=（C*稀释倍数*25）/（1000*十土重）C：还原糖的浓度（mg/L）多酚氧化酶活性采用邻苯三酚比色法多酚氧化酶主要来自土壤中的真菌、细菌和植物根系。取1g土于50ml容量瓶中，注入10ml浓度为1%的邻苯三酚，将瓶中混合物摇匀，30度培养3h，往瓶中加乙醚到刻度，用力摇多次，使生成的红紫梧精萃取到乙醚相里，当含量高时，重复萃取至乙醚无色，将所有萃取液合并，定容到一定体积，然后在430nm处比色，同时设水空白和不加土的对照。萃取液里的红紫培精的量，根据标准曲线查知。多酚氧化酶活性以每100g的红紫培精的mg数来表示。标准曲线的制作：标准溶液为重铭酸钾的溶液。准确称取0.75g重铭酸钾溶于1L0.5N的盐酸中，这个浓度的溶液相当于10ml乙醚中含有1mg红紫培精，以此溶液为基础，稀释多倍，比色，作标准曲线。过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定该酶的测定原理是基于注入土壤的过氧化氢在反应后的剩余量来测的。取2g土于125ml三角瓶，注入40ml蒸馏水和5ml0.3%的过氧化氢，250r/min震荡20min，然后加入5ml的3N的硫酸，